[發明專利]洛葵皺紋花葉病毒與馬鈴薯Ｙ病毒通用檢測引物和探針

在審

• 申請號: 201410316427.2
• 申請日: 2014-07-04
• 公開（公告）號: CN104032039A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發明（設計）人: 王利兵;朱金國;吳志鵬
• 申請（專利權）人: 王利兵;吳志鵬
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于一種基于DNA體外擴增技術的植物病毒分子生物學檢測方法，涉及針對馬鈴薯Y病毒屬內的洛葵皺紋花葉病毒與馬鈴薯Ｙ病毒的檢驗檢疫和分子生物學研究領域。

背景技術

DNA體外擴增技術又被稱為聚合酶鏈式反應，簡稱PCR（polymerase?chain?reaction），羅氏公式擁有相關專利(見美國專利4,683,195、4,683,202、4,965,188)。目前，PCR技術在分子生物學研究和檢測技術領域的應用非常普遍，相關技術資料可以參考分子克隆-實驗手冊(Molecular?Cloning-A?Laboratory?Manual，Cold?SpringHarbor，New?York)?等文獻。

洛葵皺紋花葉病毒（Basella?rugose?mosaic?virus,?BaRMV）屬于馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），已證實的宿主包括：洛葵（Basella?Rubra），蝴蝶蘭（Phalaenopsis）等。洛葵皺紋花葉病毒感染會導致植株產生皺縮花葉，是引起受感染植株退化的主要病毒之一。

馬鈴薯Ｙ病毒（Potato?Virus?Y，PVY）與洛葵皺紋花葉病毒同屬于馬鈴薯Ｙ病毒屬，其寄主范圍包括茄科及一些莧科、藜科、菊科和豆科植物，通過機械接種可感染120種植物。馬鈴薯Y病毒在湘南煙區的感染及其嚴重，特別是對于前作種植馬鈴薯或相鄰煙田種植馬鈴薯的，常常導致煙草發生馬鈴薯Y病毒嚴重感染。

洛葵皺紋花葉病毒與馬鈴薯Ｙ病毒均可通過蚜蟲傳播，也可以通過機械接種、嫁接、組織切片等方式傳播。與其它馬鈴薯Ｙ病毒屬成員一樣，馬鈴薯Ｙ病毒和洛葵皺紋花葉病毒存在于感病寄主植物的各個部分，在寄主植物細胞中產生一種由71.4kDa的CI蛋白圓構成的柱狀內含體,?在細胞質中分散或成束分布并引發不同程度的植物病征。

洛葵皺紋花葉病毒為單分體基因組病毒，病毒基因組的5'末端共價結合一個小分子Vpg蛋白。洛葵皺紋花葉病毒的基因組長9.8kb，編碼的多聚蛋白切割產生10個蛋白，按照排列順序依次為：32.4kDa的P1蛋白（功能未知），51.9kDa的HC-Pro蛋白（即輔助成分，與蚜蟲傳播有關），41.5kDa的P3蛋白（功能未知），6.0kDa的6K1蛋白（功能未知），71.4kDa的CI蛋白（即柱狀內含體蛋白，可能與病毒的胞間運動有關），5.5kDa的6K2蛋白（功能未知），21.7kDa的NIa-VPg蛋白（即VPg蛋白），27.7kDa的NIa-Pro蛋白（核內含體蛋白酶），59.8kDa的NIb蛋以及29.8kDa的外殼蛋白（Coat?Protein）。馬鈴薯Y病毒的基因結構與洛葵皺紋花葉病毒的非常相似。

國內目前對馬鈴薯Y病毒和洛葵皺紋花葉病毒的檢測主要以血清學方法和分子生物檢測法為主。血清學方法包括免疫電鏡法（Immuno-specific?electron?microscopy,?ISEM）、免疫擴散法?(SDS-immunodiffusion?test)、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、免疫斑點試驗(immunoblotting?test)、膠體金標記層析技術(Gold?immunochromatography?assay，GICA)等；分子生物檢測法包括斑點雜交法（Dot?Hybridization）、印痕雜交法（Southern?Blot或Northern?Blot）、逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）等。上述方法中，基于對檢測靈敏度和快速簡單的要求，以RT-PCR最為適用并且在實際工作中應用最廣。RT-PCR法具有極高的檢測靈敏度，非常適合于樣本的快速檢測要求。目前常用于對名貴花卉品種的檢查。

發明內容

發明目的：由于RT-PCR引物序列的高度專一性，通常情況下，對于同一樣本的不同病毒檢測需要進行多次RT-PCR擴增反應，或使用多重PCR技術，這樣既增加了實驗的復雜程度，有提高了檢測成本，從而限制了它的應用范圍。本發明的目的就是提供一種通用引物和探針序列，能夠對洛葵皺紋花葉病毒與馬鈴薯Ｙ病毒同時進行檢測，以取代多重PCR的復雜操作。