[發(fā)明專利]一種易固定化肝素酶I編碼基因及其蛋白

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410316391.8
• 申請日: 2014-07-04
• 公開（公告）號: CN104073480A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 杜宏銀;馬小來;李鋰
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市海普瑞藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶的基因工程改造，特別涉及到易固定化肝素酶I編碼基因及其蛋白。

背景技術(shù)

肝素酶是指一類能夠特異性裂解肝素和類肝素主鏈糖苷鍵的酶，最初是從肝素黃桿菌中發(fā)現(xiàn)并分離出來的，其后，又發(fā)現(xiàn)在一些微生物和動物組織中也有肝素酶存在。肝素酶具有清除血液中殘存肝素、防止凝血等功能，同時對生產(chǎn)低分子肝素、研究肝素的結(jié)構(gòu)有重要的作用。然而游離的肝素酶容易失活，尤其是肝素酶I溶液在保存96h后活性只有原來的23%，此外，游離的肝素酶在發(fā)生反應(yīng)時需要將其加入底物中，反應(yīng)以后酶溶液、底物和產(chǎn)物混合在一起不容易分離，導(dǎo)致肝素酶無法重復(fù)使用，酶的利用效率低下，這為肝素酶的應(yīng)用帶來很多不便，因此，需要尋找一種既能提高肝素酶的利用效率，又能延長酶的保存時間的方法。

與游離酶相比，固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時，又克服了游離酶的不足之處，呈現(xiàn)貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)可控等一系列優(yōu)點，因此，對肝素酶I的固定化是一種提高使用效果的理想選擇。目前對肝素酶I進行固定化的研究較少，Howard?Bernstein等[Bernstein,?H.?,?(1987),?Appl.Biochem.?Biotech.?16,?129-143]以CNBr-activated?Sepharose?4B為固定化材料，對肝素酶I進行了共價交聯(lián)法的固定化，實現(xiàn)了肝素酶的固定，但是該方法的固定化效率低，我們采用相同的材料和方法得到的結(jié)果只能達到每毫升材料固定1IU的肝素酶I，而且以CNBr-activated?Sepharose?4B為固定化材料成本較高。

經(jīng)過長期研究，本發(fā)明的發(fā)明人首次通過在肝素酶I的基因C端加上幾丁質(zhì)結(jié)合域后轉(zhuǎn)入工程菌中表達的方法，得到一種新型的易于固定化的肝素酶I，為實現(xiàn)高效且低成本的肝素酶I的固定化成為可能。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了提供一種易固定化肝素酶Ⅰ基因以及表達蛋白。

????本發(fā)明所提供的肝素酶Ⅰ蛋白，名稱為HepA-1-chBD，其肝素酶HepA-1-chBD是具有序列表中SEQ?IDNo:2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。

????序列表中的SEQ?ID?No:2由個801個氨基酸殘基組成。

????固定化肝素酶Ⅰ蛋白編碼基因，名稱為HepA-1，其具有下列核苷酸序列之一：

????1)序列表中SEQ?ID?NO.1的DNA序列：

????2)編碼序列表中SEQ?ID?No.2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；

序列1中的DNA序列由個2043個堿基組成，該基因的開放閱讀框架為自5’端第1到第2043位堿基。

擴增該蛋白編碼基因中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種表達固定化肝素酶Ⅰ蛋白的方法。

本發(fā)明所提供的表達易固定化肝素酶Ⅰ蛋白的方法，是將含有上述肝素酶Ⅰ蛋白編碼基因的重組表達載體導(dǎo)入表達宿主菌，表達肝素酶Ⅰ蛋白，且其帶有MBP標簽。

其中，所述易固定化肝素酶Ⅰ編碼基因全序列是以構(gòu)建好的PMAL-C2X-HepA為模板，以5?GACTGGATCCcaggccgacagtgctaag?3?和5?GGTCAGGCCAAGTTTtctggcagtttcgctgt?3?按照常規(guī)PCR方法得到,緊接著幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域以人工合成的幾丁質(zhì)結(jié)合域為模板,以5?CAGCGAAACTGCCAGAAAACTTGGCCTGACCGGT和5?GACTAAGCTTCTATTGAAGCTGCCACAAGGC?3,按照常規(guī)PCR方法得到后,以上述兩個PCR產(chǎn)物混合物為模板,以GACTGGATCCcaggccgacagtgctaag和GACTAAGCTTCTATTGAAGCTGCCACAAGGC?3為引物進行PCR后得到。所述宿主菌可為大腸桿菌，所述大腸桿菌可為以下菌株：BL21。

易固定化肝素酶Ⅰ蛋白的誘導(dǎo)表達條件可為0.?1mM?IPTG?.16攝氏度誘導(dǎo)20小時：所采用的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基,胰蛋白胨10g/L,NaCl?10g/L，酵母提取物5g/L。

附圖說明

圖1為HepA-1的PCR電泳圖譜。

圖2為陽性轉(zhuǎn)化子的雙酶切鑒定示意圖。

圖3為HepA-1-chBD蛋白通過直鏈淀粉樹脂親和分離的SDS-PAGE電泳圖譜。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細、完整的說明。

實施例1、缺失肝素酶Ⅰ蛋白HepA-1的表達。