[發明專利]一種Panx3基因過表達的紅色熒光慢病毒載體及其構建方法和應用無效

申請號：	201410316123.6	申請日：	2014-07-04
公開（公告）號：	CN104059943A	公開（公告）日：	2014-09-24
發明（設計）人：	黃翠;付東杰;王亞珂;宋芳芳	申請（專利權）人：	武漢大學
主分類號：	C12N15/867	分類號：	C12N15/867;C12N15/66
代理公司：	武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222	代理人：	常海濤
地址：	430072 湖***	國省代碼：	湖北;42
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種 panx3 基因表達紅色熒光病毒載體及其構建方法應用
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及到Panx3基因過表達慢病毒載體的構建，具體涉及一種Panx3基因過表達的紅色熒光慢病毒載體及其構建方法和應用。

背景技術

Panx3是2000年Panchin等在脊椎動物體內發現一類縫隙連接蛋白，是脊椎動物最主要的縫隙連接蛋白家族之一。它能形成縫隙蛋白通道，允許離子和小分子物質通過，進而使相鄰細胞以及細胞與細胞外基質相互連接，是細胞間活動同步化的基礎。目前，針對Panx3基因的功能主要表現在形成半通道，傳遞鈣離子、cAMP及ATP等信號分子，進而影響下游一系列細胞增殖、分化等功能。

慢病毒是一種分子生物學中對基因功能研究常見的工具質粒，能高效轉染原核以及真核細胞，使細胞能夠合成并且表達目的基因，通過對比目的基因在細胞內表達與否或者表達強度，實現對目的基因在細胞甚至機體功能中的作用進行驗證和分析。因此，慢病毒在研究基因在細胞及機體功能中的應用極為廣泛。由于Panx3基因的功能主要與鈣離子、ATP等相關，而目前對于鈣離子及ATP的研究方法均涉及綠色熒光的應用，而目前的相關研究設計的載體為非熒光或者綠色熒光標示，或者不能直接進行觀察轉染效果，或者與細胞內鈣離子和ATP變化的研究相干擾。因此如何直觀、有效區別慢病毒轉染細胞及細胞內鈣離子和ATP變化顯得極為重要。

發明內容

本發明的目的在于解決Panx3基因研究中過表達載體與功能研究相互干擾問題，提供一種Panx3基因過表達的紅色熒光慢病毒載體。

本發明的另一目的在于提供上述載體的構建方法。

本發明的再一目的在于提供上述載體的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種Panx3基因過表達的紅色熒光慢病毒載體，以慢病毒載體pLL3.7為骨架載體，在pLL3.7的CMV啟動子后面按照5’到3’方向插入Panx3基因、CMV啟動子和RFP（紅色熒光蛋白）基因片段（Panx3-CMV-RFP基因片段）。

優選的，所述的Panx3基因、CMV啟動子和RFP基因片段的序列如SEQ ID NO.1所示。

上述Panx3基因過表達的紅色熒光慢病毒載體的構建方法，包括如下步驟：設計5’端含有限制性內切酶酶切位點的引物，分別擴增Panx3基因、CMV啟動子和RFP基因片段，根據所擴增片段5’端的酶切位點和慢病毒載體pLL3.7酶切位點將Panx3基因、CMV啟動子和RFP紅色熒光蛋白片段連接到pLL3.7上。

優選的，所述的Panx3基因過表達的紅色熒光慢病毒載體的構建方法，包括如下步驟：

（1）提取人牙髓細胞的總RNA，以逆轉錄的cDNA為模板，PCR擴增Panx3基因片段，所用引物為：

引物1：5’-CCCAAGCTTATGTCACTTGCACACACAG-3’，

引物2：5’-CGCAAGCTTTTTGACTCTTCGGCTCCA-3’；

通過HindIII酶切位點將Panx3基因連到pCDNA3.1(+)上得到pCDNA3.1(+)-Panx3重組質粒。

（2）以Thy-Brainbrow-1.0H（Addgene中國代理公司，Plasmid 18724）質粒為模板，PCR擴增RFP紅色熒光蛋白片段，所用引物為：

引物3：5’-TCCCCCGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCG-3’，

引物4：5’-CCCTTCGAACTGGCAACTAGAAGGCACAGTCG-3’；

通過SmaI和BstBI酶切位點將RFP基因連到pCDNA3.1(+)-Panx3上得到pCDNA3.1(+)-Panx3-RFP重組質粒。

（3）以pCDNA3.1(+)為模板，PCR擴增CMV啟動子片段，所用引物為：

引物5：5’-CGCGGATCCGCTTGACCGACAATTGCAT-3’，

引物6：5’-CGCGGATCCATTTCGATAAGCCAGTAAGCAG-3’；