[發(fā)明專利]對柑桔大實蠅進行親緣關(guān)系和聚類分析的分子標(biāo)記方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410315887.3
• 申請日: 2014-07-03
• 公開（公告）號: CN104087664A
• 公開（公告）日: 2014-10-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉浩強;冉春;李鴻筠;叢林;胡軍華;姚廷山
• 申請（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)柑桔研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務(wù)所(普通合伙) 50211
• 代理人: 譚春艷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種分子標(biāo)記方法，尤其涉及一種對柑桔大實蠅進行親緣關(guān)系和聚類分析的分子標(biāo)記方法。?

背景技術(shù)

柑桔是世界第一大水果，年產(chǎn)量超過1億噸，約占世界水果總產(chǎn)量的四分之一。目前柑桔業(yè)已成為中國南方廣大地區(qū)、貧困山區(qū)和三峽庫區(qū)農(nóng)村經(jīng)濟支柱產(chǎn)業(yè)之一。柑桔大實蠅Bactrocera(Tetradacus)minax(Enderlein)俗稱“柑蛆”，又名柑桔大實蠅，柑桔大果蠅，被害果稱“蛆果”、“柑蛆”，是國際國內(nèi)植物檢疫性有害生物。傳統(tǒng)的柑桔大實蠅鑒定方法一直是以形態(tài)學(xué)為主要依據(jù)，但該方法在幼蟲期不能準(zhǔn)確快速的檢測與鑒定出柑桔大實蠅。搞清楚柑桔大實蠅不同地理種群之間的遺傳關(guān)系對柑桔大實蠅的系統(tǒng)鑒定很有必要，因此需要發(fā)展一種能夠快速、準(zhǔn)確的對柑桔大實蠅進行親緣關(guān)系分析和分類的方法。?

RAPD(Random?Amplified?poloymorphic?DNA)作為顯性分子標(biāo)記，具有操作簡單、快速,成本較低,對DNA的純度要求不高等特點，在種屬特異性鑒定等方面被廣泛地應(yīng)用。而SRAP(Sequence-Related?Amplified?Polymorphism)標(biāo)記是基于DNA分子標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)缺點基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新的分子標(biāo)記技術(shù)，其引物設(shè)計簡單，尤其是正向引物的CCGG和反向引物的AATT核心序列對基因的ORF?進行擴增，顯著提高了擴增結(jié)果與表型/基因型的相關(guān)性，擴增產(chǎn)物因不同物種、不同基因型的內(nèi)含子、啟動子與間隔長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性，SRAP標(biāo)記在物種種群遺傳結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系分析中得到了廣泛的應(yīng)用。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種對柑桔大實蠅進行親緣關(guān)系和聚類分析的分子標(biāo)記方法，有助于快速、準(zhǔn)確地辨析區(qū)域間柑桔大實蠅種群的親緣關(guān)系，對柑桔大實蠅進行聚類分析,區(qū)分不同的種群。?

本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案：一種對柑桔大實蠅進行親緣關(guān)系和聚類分析的分子標(biāo)記方法，包括如下步驟：?

(1)提取待測柑桔大實蠅樣品的DNA，保存?zhèn)溆茫?

(2)用7條RAPD引物對步驟1得到的DNA進行PCR擴增，所述的7條RAPD引物名稱和序列如下：1：ACGCCAGAGG，2：GAGCGAGGCT，3：CAGGGGTGGA，4：GGTCTGGTTG，S75：GACGGATCAG，Y06：AAGGCTCACC，Y18：GCTGAGTCAG；?

(3)用10對SRAP引物組合對步驟1得到的DNA分別進行PCR擴增，所述的10對SRAP引物組合名稱為：3F-1R，3F-2R，9F-1R，9F-3R，9F-2R，9F-11R，4F-10R，12F-11R，10F-3R，10F-10R；其中，所述各引物序列如下：?

(4)將步驟2、3得到的擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并拍照記錄結(jié)果，統(tǒng)?計被檢測材料的擴增帶，有帶計為“1”，無帶計為“0”，強帶和弱帶均計為“1”，組成“0-1”數(shù)據(jù)矩陣；用遺傳分析軟件進行分析，獲得個體之間的遺傳距離，根據(jù)個體間的遺傳距離聚類結(jié)果，繪制不同地理種群柑桔大實蠅的聚類圖，區(qū)分不同的類群。?

所述步驟2中的PCR反應(yīng)體系為：總體積為25uL的PCR反應(yīng)體系含1×PCR?Buffer2.0μL、1.5mmol/μL?MgCl₂?1.5μL、500μmol/L?dNTPs1.5μL、0.5μmoL/L引物1.0μL、1U?Taq酶0.4μL、20ng/μL?DNA模板1.0μL,補超純水至25μL。?

所述步驟3中的PCR反應(yīng)體系為：總體積為25uL的PCR反應(yīng)體系含1×PCR?Buffer2.0μL、1.5mmol/μL?MgCl₂?1.5μL、500μmol/L?dNTPs1.5μL、0.5μmoL/L的上下游引物各1.0μL、1U?Taq酶0.4μL、20ng/μL?DNA模板1.0μL,補超純水至25μL。?

所述步驟2中的PCR擴增程序為:94℃預(yù)變性5min；94℃60s，38℃60s，72℃90s，共32次循環(huán)；72℃延伸10min。?

所述步驟3中的PCR擴增程序為:94℃預(yù)變性3min；94℃40s，63℃40s，72℃60s，循環(huán)15次，每次循環(huán)退火溫度降低0.5℃；94℃40s，55.5℃40s，72℃60s，循環(huán)25次；72℃延伸10min。?