[發(fā)明專利]口腔鱗狀癌診斷試劑盒及MYH7基因在其制備中的用途

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410315640.1
• 申請(qǐng)日: 2014-07-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104059985A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊承剛;宋宏濤;邊洋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 楊承剛
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種口腔鱗狀癌診斷試劑盒及MYH7基因在制備口腔鱗狀癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

在我國(guó)，口腔頜面部的惡性腫瘤以癌為最常見(jiàn)，肉瘤較少。在癌瘤中又以鱗狀細(xì)胞癌為最多見(jiàn)，一般占80％以上。口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral Cancer)的發(fā)生是個(gè)多因素、多步驟、多階段的復(fù)雜過(guò)程，在這些過(guò)程中，涉及眾多基因表達(dá)的改變，導(dǎo)致細(xì)胞正常生理過(guò)程及大分子代謝紊亂，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻，細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變及免疫調(diào)節(jié)紊亂等，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，最終形成癌。與口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病相關(guān)的因素既包括各種理化刺激、致瘤性病毒等外源性因素，又包括機(jī)體的免疫狀態(tài)、遺傳易感性以及DNA損傷修復(fù)能力等內(nèi)源性因素。在口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生過(guò)程中最重要的機(jī)制是細(xì)胞中原癌基因激活和抑癌基因失活，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖和(或)凋亡調(diào)節(jié)失控。

高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-sep)是在轉(zhuǎn)錄組水平上進(jìn)行深度測(cè)序的一項(xiàng)技術(shù)，測(cè)序技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組分析中的應(yīng)用主要集中在基因表達(dá)譜的構(gòu)建、新基因的發(fā)現(xiàn)、小分子非編碼RNA表達(dá)譜的構(gòu)建和新小分子RNA基因的發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)編碼基因注釋、以及如fusion transcript等轉(zhuǎn)錄組研究上。數(shù)據(jù)在最初的處理上是大體是相似的，接下來(lái)針對(duì)不同的研究目的可以選用不同的生物信息學(xué)軟件進(jìn)行計(jì)算。

利用大規(guī)模測(cè)序技術(shù)直接對(duì)由mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA序列進(jìn)行測(cè)序，產(chǎn)生數(shù)以千萬(wàn)計(jì)的reads數(shù)量，從而使得一段特殊的基因組區(qū)域的轉(zhuǎn)錄水平可以直接通過(guò)比對(duì)到該基因組區(qū)域的reads數(shù)來(lái)衡量。該技術(shù)常用來(lái)構(gòu)建某一特定組織或細(xì)胞的基因表達(dá)譜，通過(guò)對(duì)正常組織和病變組織進(jìn)行基因表達(dá)譜的分析，得到在兩種組織中差異表達(dá)的基因，一方面為研究疾病的發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制提供新的思路，另一方面為疾病的診斷和治療提供新的診斷標(biāo)記物或新的藥物靶點(diǎn)。

利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選與口腔鱗狀細(xì)胞癌密切相關(guān)的基因，不僅有利于研究口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展的病理機(jī)制，而且為診斷和治療口腔鱗狀細(xì)胞癌提供新的診斷標(biāo)志物或新的藥物靶點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明利用高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)MYH7基因在口腔鱗狀癌組織中的表達(dá)與在正常組織中的表達(dá)存在差異，與正常組織相比，MYH7基因在口腔鱗狀癌組織中表達(dá)下調(diào)，通過(guò)檢測(cè)MYH7基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況，可以判斷受試者是否患有口腔鱗狀癌。

本發(fā)明的目的在于提供MYH7基因在制備診斷口腔鱗狀癌的試劑盒中的用途。所述診斷試劑盒包含SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系、用于擴(kuò)增MYH7基因和管家基因的引物對(duì)。SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系包含PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。

上述技術(shù)方案中，PCR緩沖液為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)，優(yōu)選地，PCR緩沖液包含：25mM KCl，2.5mM MgCl₂，200mM(NH₄)₂SO₄。

引物對(duì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)引物設(shè)計(jì)的常規(guī)設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)；優(yōu)選的實(shí)施方案中，擴(kuò)增MYH7基因的正向引物序列為5’-ATGGACCTGGAGAATGAC-3’，反向引物序列為5’-CAATCCTTGCGTTGAGAG-3’；管家基因優(yōu)選GAPDH，擴(kuò)增該基因的正向引物序列為5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列為5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。

在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄體系，該逆轉(zhuǎn)錄體系包含：T重復(fù)寡核苷酸Oligo(dT)、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs。

優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包含：250mM PH8.3的Tris-HCL，375mM的KCL，15mM的MgCl₂，50mM的DTT。

RNA酶抑制劑可選用本領(lǐng)域常用的RNA酶抑制劑，優(yōu)選為大腸桿菌表達(dá)的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制RNA酶的重組蛋白酶。

在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含RNA提取試劑，RNA酶提取試劑包含Trizol、氯仿、異丙醇、75％乙醇。

本發(fā)明的診斷試劑盒保存于-20℃，盡量減少反復(fù)凍融。