[發明專利]一種血管瘤動物模型的建系方法

有效

• 申請號: 201410315187.4
• 申請日: 2014-07-03
• 公開（公告）號: CN104087615B
• 公開（公告）日: 2018-07-17
• 發明（設計）人: 徐骎;謝芙蓉;余婧爽;陳萬濤
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

1.一種血管瘤動物模型的建系方法，包括：

(1)血管內皮細胞特異表達的PyMT基因質粒的構建；

所述質粒中包含血管內皮細胞特異表達的啟動子Tie2、真核生物轉錄所需Kozak序列、PyMT基因全序列、SV40polyA信號和Tie2增強子序列；

(2)將上述構建好的質粒經PvuI酶切線性化，回收7.0kb的DNA片段；然后將上述DNA片段注射到受精卵的雄原核中，再移植到0.5天假孕鼠的輸卵管中，得小鼠；

(3)將出生的小鼠進行PCR鑒定；

(4)將步驟(3)鑒定后的轉基因小鼠作為培育轉基因動物品系基礎種群的首建鼠建立血管瘤動物模型。

2.根據權利要求1所述的血管瘤動物模型的建系方法，其特征在于：步驟(1)中所述的血管內皮細胞特異表達的PyMT基因質粒構建的具體操作方法為：

以鼠尾DNA為模板，分別PCR擴增Tie2啟動子，Tie2增強子，以pPymt為模板PCR擴增PyMT基因全長；PCR體系為：模板DNA：1μl，5xPCR緩沖液：4μl，三磷酸脫氧核糖核苷：1μl，PCR引物混合物：2μl，PCR聚合酶：0.2μl，雙蒸水：11.8μl；反應程序為：95℃3分鐘，98℃15秒，55℃-68℃15秒，72℃90秒，72℃5分鐘，35個循環；用KpnI和SalI酶切Tie2啟動子序列，XhoI和NheI酶切PyMT基因序列，XbaI和ClaI酶切載體連接片段序列，ClaI和SalI酶切Tie2增強子，依次連接到pGL3-Basic載體上；

上述構建用引物如下：

Tie2啟動子上游引物catggtaccgcggaagcttactaagatctaatgaaaatc；

Tie2啟動子下游引物catgtcgacTTCAACAACTCACAACTTTGCG；

Pymt上游引物catctcgagagcctcaccaccatcATGGATAGAGTTCTGAGCAGAG；

Pymt下游引物catgctagcCTAGAAATGCCGGGAACG；

載體連接片段上游引物GTGTAATTCTAGAGTCGGGGC；

載體連接片段下游引物CGACGGATCCTTATCGATTTTACC；

Tie2增強子上游引物catatcgatctcgaggtccagtatggcttc；

Tie2增強子下游引物catgtcgacgtaccattattgttttacttgggagg。

3.根據權利要求2所述的血管瘤動物模型的建系方法，其特征在于：所述鼠尾DNA的制備如下：取出生10天的C57BL/6J小鼠鼠尾0.3cm，加450μl裂解液及10mg/ml的50μl蛋白酶K，56℃消化過夜；離心取上清液，無水乙醇沉淀，70％乙醇洗滌，稍晾干后 溶解于200μl純水中，即可。