[發明專利]桔小實蠅細胞色素P450基因的RNA干擾載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201410315113.0
• 申請日: 2014-07-03
• 公開（公告）號: CN104059931B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發明（設計）人: 冉春;岳建蘇;劉浩強;叢林;李鴻筠
• 申請（專利權）人: 西南大學柑桔研究所
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/113;C12N15/66;C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所(普通合伙)50211
• 代理人: 譚春艷

1.桔小實蠅細胞色素P450基因的RNA干擾載體，包括骨架載體和正、反義鏈，其特征在于：以桔小實蠅細胞色素P450基因部分片段為正或反義鏈，所述細胞色素P450基因部分片段序列如SEQIDNO.1，所述骨架載體為PFGC5941載體。

2.根據權利要求1所述的桔小實蠅細胞色素P450基因的RNA干擾載體，其特征在于：所述正義鏈插入在酶切位點XhoI和NcoI之間，反義鏈插入在酶切位點XbalI和BamHI之間。

3.根據權利要求2所述的桔小實蠅細胞色素P450基因的RNA干擾載體的構建方法，包括如下步驟：

1)細胞色素P450基因目的片段與質粒的連接

提取桔小實蠅總RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，以SEQIDNO.2和SEQIDNO.3為引物對細胞色素P450基因的正向目的片段進行PCR擴增，以SEQIDNO.4和SEQIDNO.5為引物對細胞色素P450基因的反向目的片段進行PCR擴增，得到PCR產物，目的片段約為600bp，回收PCR產物，與載體pMD-19連接，轉化大腸桿菌DH5α得到重組質粒pMD-19-P1F1和pMD-19-P2F2，進行序列驗證，測序正確的目的片段即可用于RNA干擾載體的構建；所述SEQID NO.2～5的序列如下：

SEQIDNO.2：5’-GCCATGGATAGTCTGAACGAACCGAA-3’；

SEQIDNO.3：5’-CCATGGGATAGATTTCGGGATCAC-3’；

SEQIDNO.4：5’-GCTCTAGAGCATAGTCTGAACGAACCGAA-3’；

SEQIDNO.5：5’-CGGGATCCGATAGATTTCGGGATCAC-3’；

2)細胞色素P450基因的RNA干擾載體的構建

將上述測序正確的細胞色素P450基因正向目的片段質粒pMD-19-P1F1與載體PFGC5941分別用XhoI和NcoI雙酶切，將pMD-19-P1F1與載體PFGC5941的酶切產物進行連接得到插入正向目的片段的重組質粒PFGC5941-P1F1；將PFGC5941-P1F1和細胞色素P450基因反向目的片段質粒pMD-19-P2F2分別用XbalI和BamHI雙酶切，將酶切產物進行連接，即可得到插入正、反義鏈的RNA干擾載體PFGC5941-P1F1/P2F2，經PCR擴增檢測、核苷酸序列分析，目的片段序列正確的干擾載體可用于農桿菌轉化。

4.權利要求1-2任一所述的桔小實蠅細胞色素P450基因的RNA干擾載體在轉基因植物中的應用，所述轉基因植物為柑橘屬植物。

5.根據權利要求4所述的應用，為將權利要求1-2任一所述的桔小實蠅細胞色素P450基因的RNA干擾載體轉化有關受體植物，使之對桔小實蠅產生抗性，所述受體植物為柑桔。

6.根據權利要求5所述的應用，所述轉化的方法為農桿菌介導法。

7.根據權利要求6所述的應用，所述農桿菌為農桿菌菌株EHA105。