[發明專利]一種分離抗菌肽的方法

有效

• 申請號: 201410315033.5
• 申請日: 2014-07-03
• 公開（公告）號: CN104327175B
• 公開（公告）日: 2017-12-29
• 發明（設計）人: 金志敏;周奎;栗金權
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/30;C07K1/14
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司33201
• 代理人: 黃美娟,王曉普

(一)技術領域

本發明涉及一種分離抗菌肽的方法，具體涉及從家蠅蛹粗提液中分離出抗菌肽，屬于生物化工領域。

(二)背景技術

抗菌肽是一類由生物體產生的具有抗菌活性的堿性多肽，由20～60個氨基酸殘基組成。這類活性多肽多數具有強堿性、熱穩定性以及廣譜抗菌等特點，被稱為“第二防御體系”。瑞典科學家G.Boman等人在研究北美天蠶的免疫機制時，發現其滯育蛹經注射陰溝通桿菌及大腸桿菌等外界刺激誘導后，其血淋巴中產生了具有抑菌活性作用的多肽物質，由此分離獲得世界上第一個抗菌多肽—天蠶素(Cecropins)。此后，人們從其他昆蟲以及兩棲類動物、哺乳動物中也分離到結構相似的抗菌多肽，已有幾十種抗菌多肽的結構被測定，對其作用機理進行了大量研究。一般認為抗菌肽作用過程如下：抗菌肽作用于細胞膜，在膜上形成跨膜的離子通道，破壞了細胞膜的完整性，引起細胞膜通透性改變，造成細胞內小分子物質泄漏，破壞了細胞正常滲透壓平衡，從而殺死細胞。

抗菌肽屬于生物體非專一性免疫應答的產物，能夠抑殺多種細菌、真菌，能夠加速免疫過程，并且對正常細胞無損傷。人們利用抗菌肽的特性，將其應用于不同領域?？咕脑谌栈闷分衅鸬綒⒕鬃饔茫辉谥参锊∠x害防治方面，以其對真菌的強大殺傷作用而得以應用；利用其穩定性可以作為綠色飼料的添加劑；在醫藥方面，由于其抗菌活性高和不宜引起抗藥性，已經成為了人們對抗病原細菌和真菌感染的藥物之一；抗菌肽還在生物農藥方面有所應用，成為對環境無污染的友好產品。隨著人們對抗菌肽研究的深入，其應用必將愈加廣泛。

專利CN201110392455.9公開了一種分離天蠶素抗菌肽的方法，將含有天蠶素抗菌肽的發酵液經微濾膜過濾，收集微濾透過物；對微濾透過物進行超濾膜過濾，收集超濾透過物；對透過物進一步納濾膜過濾，收集納濾截留物，即得到天蠶素抗菌肽。此發明采用膜過濾的方法實現了對抗菌肽的濃縮分離，具有能耗低，收率高的特點，但所獲得納濾截留物濃度較低，產品純度有待進一步提高。專利CN201110345856.9公開了一種從諸葛菜中提取抗菌肽的方法，將諸葛菜研磨成漿，加入可溶蛋白提取緩沖液，處理后獲得上清液，加入(NH₄)₂SO₄溶液除去雜蛋白等物質，然后采用離子交換層析、透析等操作獲得抗菌肽濃縮液，之后過分子篩獲得活性諸葛菜抗菌肽。此法以諸葛菜為原材料，降低了成本，利用離子交換層析、透析等操作濃縮抗菌肽，提高了提取效率，但離子交換層析在工業化生產中不宜大規模應用。專利CN200710176477.5公開了一種提取豬血抗菌肽的方法，將豬血溶于緩沖液中，利用木瓜蛋白酶進行酶解，使用氯仿和亞硫酸氫鈉對酶解液脫色，獲得豬血抗菌肽的粗提物。精制過程如下：將粗提物過凝膠型陽離子交換柱，對離子交換柱進行洗脫，收集洗脫液，進行真空冷凍干燥。此方法操作簡單，成本較低，操作條件溫和，反應條件易于控制，適于少量抗菌肽的提取，并且還需要對酶解產物進一步的確定。專利CN200810218932.8公開了家蠅蛹天然抗菌肽制品及其制備方法和應用，此專利以家蠅蛹為原材料，經過酸過夜和熱處理后得到上清液；上清液經分子篩過濾和超濾處理，然后進行噴霧干燥后得到抗菌肽制品。以此發明來制備抗菌肽及其制品，具有工藝簡便快速的特點，適于對于抗菌肽產品質量要求低的制品。專利CN200710200375.2公開了一種家蠅分泌型抗菌肽的分離方法及其產品和應用，將抗菌肽粗提液進行透析，透析內液經固相萃取，洗脫組分經超濾分離，活性組分用反相高效液相色譜純化，即得家蠅分泌型抗菌肽。此發明提供了一條高效、抗菌活性穩定性較好的抗菌肽提取路線，提高了分離純化的效率。但采用反相高效液相色譜純化不適于工業規?；a。

隨著人們對抗菌肽需求量的不斷增加，對其純度和抗菌活性的要求也在不斷提高。其來源主要有三個方面：天然提取、化學合成、基因工程。由于抗菌肽分子量小，天然抗菌肽含量較少，分離純化困難，提取產率低，在生產實踐中面臨許多困難?；瘜W合成可以避免分離純化問題，但是化學合成成本較高。利用基因工程方法，可以降低合成抗菌肽的成本，但基因工程同樣遇到一些瓶頸，例如依然存在表達產物少等問題。

為此我們提出一種分離抗菌肽的方法：單寧接枝硅藻土選擇性共沉淀法。