[發明專利]一種利用DNA損傷修復機制使單克隆抗體細胞株進行體內快速進化的新方法

有效

• 申請號: 201410314564.2
• 申請日: 2014-07-03
• 公開（公告）號: CN104263755B
• 公開（公告）日: 2017-02-15
• 發明（設計）人: 劉聰;章崇杰
• 申請（專利權）人: 成都中聯生科基因科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體為一種利用DNA損傷修復機制對單克隆細胞株進行體內快速進化的新方法。?

背景技術

單克隆抗體(monoclonal?antibody，mAb)，簡稱單抗，是僅由可以制造這種抗體的免疫細胞與癌細胞融合后的雜交瘤細胞產生的。將這種雜交瘤作單個細胞培養，可形成單細胞系，即單克隆。利用培養或小鼠腹腔接種的方法，便能得到大量的、高濃度的、非常均一的抗體，其結構、氨基酸順序、特異性等都是一致。單克隆抗體可直接用于人類疾病的診斷、預防、治療以及免疫機制的研究，為人類疾病的免疫診斷與免疫治療開辟了廣闊前景。?

單克隆抗體較多克隆抗體具有如下幾個優點。1.雜交瘤實現體外永生化并持續傳代，只要不發生細胞株的基因突變，就可以不斷地生產高特異性、高均一性的抗體。2.由于可能得到“無限量”的均一性抗體，使得抗體作為藥物成為可能。3.可以實現標準化生產，用于以標記抗體為特點的免疫學分析方法。4.由于單克隆抗體的高特異性和單一生物學功能，可用于治療性藥物、放射免疫顯像、醫學診斷試劑甚至環境污染的檢測等廣泛領域。單克隆抗體的制備雖然在細節上有各種優化，但是技術框架已經相對成熟。?

人源化/全人源單克隆抗體的設計與開發的技術流程包括靶點選擇與驗證、針對靶點單抗制備、抗體篩選、抗體基因克隆、抗體人源化、抗體親和成熟、人抗體制備、動物模型研究和臨床試驗等。目前，抗體藥物研發很多方面還存在較大的發展空間。其中，抗體親和力和特異性等特性的提升是抗體研發最為關鍵，也是最容易遭遇技術瓶頸的的步驟。?

抗體庫容量的產生機制主要包括組合多樣性、連接多樣性和體細胞高頻突變，而高親和力抗體是在體細胞高頻突變和抗原選擇下產生的。B細胞在識別抗原后發生分裂增殖的過程中產生體細胞高頻突變，且突變主要集中在重、輕鏈可變區內決定抗體與抗原親和力的互補決定區(CDR)。因此，體細胞高頻突變能產生高親和力的抗體，而具有高親和力抗體的B細胞在低濃度抗原刺激下會優先?活化增殖，逐漸形成高親和力的B細胞優勢細胞群，進一步分泌產生高親和力抗體。?

抗體庫技術是利用分子克隆技術擴增全套抗體重、輕鏈可變區基因，然后與特定的表達載體連接，轉化到宿主細胞中表達出有功能的抗體，并通過親和篩選等方法篩選到高親和力的特異性抗體。抗體庫技術經歷體內和體外發展階段，其中體內以噬菌體抗體庫技術最為常見，體外以核糖體和mRNA抗體庫技術最為常見。抗體庫方法和技術通過模擬抗體在機體內生成的重要環節，如多樣性B細胞群體、克隆選擇、親和力成熟等，加快了抗體制備的速度，降低了生產成本，為快速從大庫容量的抗體庫中篩選并大規模制備高親和力特異性抗體提供了簡便而高效的操作系統。但是抗體庫方法和技術目前仍然存在亟待解決的問題，例如在保證抗體庫多樣性和呈現效率的同時，如何提高庫容量以及抗體產量等問題。而且抗體的輕鏈可變區對于抗體的穩定性，親和力非常重要，這就造成現有體外抗體演化技術不可逾越的瓶頸。?

發明內容

針對上述問題，本發明公開了一種我們研發了基于單克隆抗體細胞株的體內抗體進化技術。該方法利用AID突變體及控制其在CDR區的招募情況可以使可變區的突變幾率達到10^-3-10^-2/代，可以用于高親和力抗體快速篩選工藝。?

為達到上述目的，本發明的實施采用如下方案。?

首先在NCBI上查詢確定小鼠AID、DDB1和SIRT2基因的標準序列，再根據核酸序列設計相應的擴增引物。將這三個基因通過同源重組的方法克隆至慢病毒骨架載體。AID基因的38位氨基酸通過定點突變方法轉換為甘氨酸(AID?mutant)。?

進一步的根據三質粒慢病毒系統方法，包裝獲得病毒上清，再進行轉染獲得分別轉染進Plv-AID、Plv-DDB1和Plv-SIRT2單質粒，Plv-DDB1和Plv-SIRT2雙質粒及三質粒共轉的五個穩定的細胞系。?

進一步的通過使用OMEGA公司的RNA提取試劑盒提取Plv-AID?mutant、Plv-DDB1和Plv-SIRT2單質粒及三質粒共轉的細胞系中RNA進行反轉獲得CDNA。在進一步用PCR的方法檢查Plv-AID?mutant、Plv-DDB1和Plv-SIRT2單質粒及三質粒共轉的細胞系中抗體突變率的變化情況。確定三質粒共轉的細胞系中抗體突變進化率最高。?