[發明專利]一次性檢測肺癌多重基因的引物、探針、檢測體系和試劑盒

有效

• 申請號: 201410313324.0
• 申請日: 2014-07-02
• 公開（公告）號: CN104818318B
• 公開（公告）日: 2018-03-20
• 發明（設計）人: 黃蛤目;林清華;施偉杰;江風閣;宋慶濤;阮力;鄭立謀
• 申請（專利權）人: 廈門艾德生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司35204
• 代理人: 張松亭

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地涉及肺癌多重基因的引物、探針及檢測體系。

背景技術

肺癌是惡性腫瘤中發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌的85％左右。我國是肺癌發病率最高的國家，每年約有60萬人被確診為肺癌。在過去的30年里，肺癌的病死率增加了464.84％，據世界衛生組織(WHO)估計，截至2025年，我國每年肺癌死亡病例將達到100萬。目前化療仍是肺癌最主要治療手段，雖然隨著新一代化療藥物的出現，肺癌療效有了一定程度的提高，但肺癌患者的總生存率仍然較低，究其原因，主要是大多數肺癌由于缺乏高靈敏度的基因突變檢測和確診技術以及與之相匹配的科學的治療方案,從而失去了治療的最佳時機。近年來，分子靶向治療已經成為肺癌研究熱點，越來越多分子靶點的發現及靶向藥物的研發給肺癌患者長期生存帶來了希望。隨著腫瘤個體化治療理念的提倡、分子檢測技術的進步和靶向治療藥物的不斷推出，肺癌核酸標志物檢測指導治療方案引起了眾多學者的關注和探討，其研究熱點主要集中于EGFR、BRAF、KRAS、ALK、ROS1等靶點。

目前，從法國報道的1000例的肺癌BM項目研究、美國LCMC項目等項目顯示肺癌分子靶點的多基因檢測和篩查意義重大，有助臨床實踐和臨床試驗，能顯著改善患者生存質量。然而，目前大多每次只能檢測一個突變或一段基因的突變，檢測通量低，只能逐個篩查，耗時長。同時，由于晚期患者取材較難，樣本量較少，往往不能滿足逐個篩查的需要，且臨床上尚無能夠同時、一次性完成對此5個熱點基因進行檢測的試劑盒。

本發明提供一種高靈敏度和高特異性的用于一次性檢測多重肺癌基因的引物、探針、試劑盒及引物分配方式。該檢測試劑盒利用DNA樣本進行基因突變和RNA樣本進行基因融合的檢測，特異性和靈敏度高，檢測結果重復性好，而且引入了熒光檢測技術，克服了傳統PCR產物遺留污染的問題，操作簡便快捷，為臨床EGFR、BRAF、KRAS、ALK和ROS1基因突變/融合的檢測提供了一種快速可靠的檢測方法。該方法可以實現一次性檢測肺癌的多重基因，大大縮短了檢測的時間，提高了肺癌基因檢測的靈敏度和準確率，從而實現指導肺癌臨床治療方案制定及化療預后。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于一次性檢測多重肺癌基因的引物、探針，包括EGFR、BRAF、KRAS、ALK和ROS1等熱點基因的引物、探針及分配方式，其序列如表1：

表1引物、探針以及序列號

本發明的另一目的在于提供一次性檢測多重肺癌基因的試劑盒。本試劑盒包括兩個部分：RNA融合基因檢測和DNA基因突變檢測，包含EGFR、KRAS、BRAF、ALK、ROS1等突變基因的特異性引物、新型探針，還包括PCR緩沖液、UNG酶等。試劑盒采用12聯PCR反應條設計，其中RNA融合基因檢測由12聯PCR反應條的1-3號孔組成，其中1號孔由ALK融合基因檢測試劑和內控檢測試劑組成，2和3號孔都由ROS1融合基因檢測試劑和內控檢測試劑組成。1-3號孔融合基因檢測試劑由FAM信號指示，內控檢測試劑用于監控樣本RNA質量及加入情況，由HEX(VIC)信號指示；DNA基因突變檢測由12聯PCR反應條的4-12號孔組成，其中4-7號孔由EGFR基因突變檢測試劑和內控檢測試劑組成，8-10號孔由KRAS基因突變檢測試劑和內控檢測試劑組成，11號孔由BRAF基因突變檢測試劑和內控檢測試劑組成，12號孔由擴增EGFR外顯子的檢測試劑組成。其中4-11號孔基因突變檢測試劑由FAM信號指示，內控檢測試劑用于監控樣本DNA加入情況，由HEX(VIC)信號指示；12號孔的檢測試劑用于監控樣本DNA質量，由FAM信號指示。

每一樣本檢測需要1條12聯PCR反應條。本試劑盒組成詳見表2和表3。本發明通過一次性對樣本DNA中基因突變和RNA中基因融合的檢測，指導肺癌臨床治療方案制定和化療預后。

表2試劑盒組成

表3EARKB12聯PCR反應條組成成分

表4試劑盒檢測所有融合和突變類型信息

本發明另一方面提供一種用于一次性檢測肺癌基因檢測的反應體系，具體如下：

①融合基因