[發(fā)明專利]一種制備iGb3S基因敲除的非人哺乳動(dòng)物的方法及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410313280.1
• 申請(qǐng)日: 2014-07-02
• 公開（公告）號(hào): CN104120147A
• 公開（公告）日: 2014-10-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐麗明;邵安良;范昌發(fā);單永強(qiáng);陸艷;章娜;楊昭鵬;林永亮;徐斌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)食品藥品檢定研究院
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;A61D19/04;A61D19/00;A01K67/027;C12N5/10
• 代理公司: 北京元中知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11223
• 代理人: 王明霞

1.一種制備iGb3S基因敲除的非人哺乳動(dòng)物的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)構(gòu)建打靶載體：從基因組DNA中分離iGb3S基因，經(jīng)長(zhǎng)鏈PCR方法擴(kuò)增獲得同源臂，與抗生素耐藥基因復(fù)合構(gòu)建打靶載體；

(2)將打靶載體轉(zhuǎn)入到胚胎細(xì)胞，將重組胚胎細(xì)胞注入代孕動(dòng)物胚胎中，移植到假孕動(dòng)物體內(nèi)，與正常動(dòng)物交配；

(3)對(duì)得到的嵌合體動(dòng)物進(jìn)行基因型驗(yàn)證，篩選基因成功敲除的陽性基因敲除的嵌合體動(dòng)物；進(jìn)一步與野生型動(dòng)物交配，獲得F1代雜合子；F1代雜合子之間交配后獲得兩條染色體均被剔出的純合子動(dòng)物，建系獲得基因敲除動(dòng)物種群。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備iGb3S基因敲除的非人哺乳動(dòng)物的方法，其特征在于，所述的非人哺乳動(dòng)物為小鼠，進(jìn)一步優(yōu)選C57BL小鼠。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備iGb3S基因敲除的非人哺乳動(dòng)物的方法，其特征在于，所述的iGb3S基因敲除為敲除iGb3S基因的功能性催化區(qū)第五外顯子，其核苷酸序列如SEQ?NO?ID:1所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備iGb3S基因敲除的非人哺乳動(dòng)物的方法，其特征在于，所述打靶載體含有5`同源臂、耐藥抗生素基因NeoR-PA和3`同源臂，用NeoR-PA取代第5外顯子。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備iGb3S基因敲除的非人哺乳動(dòng)物、子代、胚胎或細(xì)胞的方法，其特征在于，耐藥抗生素基因NeoR-PA5`端和3`端的同源臂序列取自小鼠第四條染色體上iGb3S基因第五外顯子的5`端和3`端，分別為8.3kb和9.1kb。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備iGb3S基因敲除的非人哺乳動(dòng)物的方法，其特征在于，構(gòu)建打靶載體的步驟為：

(1)從正常C57BL/6J小鼠分離基因組DNA，擴(kuò)增第5外顯子5’端C1片段、A片段和3’端B片段、C2片段，分別連接到pBlunt載體；

(2)將酶切鑒定、測(cè)序正確的A和B片段依次連接到pL452載體得到pL452-iGb3S-A-B，同時(shí)，通過Overlap?PCR將測(cè)序正確的C1、C2片段融合后連接到pDTA-Down載體上；

(3)將連接正確的pL452-iGb3S-A-B用EcoRV酶切，pL452-AB切出2880bp、2885bp兩條帶，回收目的片段A-NeoR-B，電轉(zhuǎn)含pBCTG的BAC菌進(jìn)行重組；菌落PCR檢測(cè)A-NeoR-B片段重組BAC，鑒定擴(kuò)增條帶正確；

(4)pDTA-down-iGb3S-C的線性化處理，即EcoRV酶切處理pDTA-Down-iGb3S-C，回收目的條帶，電轉(zhuǎn)已經(jīng)重組了NeoR的iGb3S的BAC菌；pDTA-iGb3S-C拯救iGb3S-NeoR?BAC(AmpR+KanR)；對(duì)C拯救后的菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)鑒定，將重組正確克隆進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)Stbl3純化后酶切驗(yàn)證。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備iGb3S基因敲除的非哺乳動(dòng)物、子代、胚胎或細(xì)胞的方法，其特征在于，步驟(2)包括以下步驟：制備不育雄鼠和假孕母鼠；超排卵；收獲受精卵；目的DNA的制備；將目的DNA導(dǎo)入受精卵；受精卵的移植；首建鼠中目的DNA整合情況的檢測(cè)；通過雜交繁育基因剔出小鼠種系。

8.一種來自權(quán)利要求1所述的基因敲除動(dòng)物的精子、卵細(xì)胞、受精卵、胚胎、子代、組織或細(xì)胞。

9.一種如權(quán)利要求1所述的基因敲除的非人哺乳動(dòng)物或如權(quán)利要求8所述的精子、卵細(xì)胞、受精卵、胚胎、子代、組織或細(xì)胞在生物源性材料中的應(yīng)用；所述生物源性材料包括動(dòng)物源性或取自人體的，所述的動(dòng)物源性生物材料不包括靈長(zhǎng)類動(dòng)物；所述的動(dòng)物源性生物材料的種類包括取自動(dòng)物體內(nèi)的各種組織、臟器及其衍生物，或者由組織或臟器制備的各種材料；所述的靈長(zhǎng)類動(dòng)物優(yōu)選古世紀(jì)猴、狒狒。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用包括在免疫學(xué)研究、免疫毒理學(xué)、免疫排斥反應(yīng)及其機(jī)理的研究、安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用，所述的安全性評(píng)價(jià)包括生物源性材料在臨床試驗(yàn)前的安全性評(píng)價(jià)。