[發(fā)明專利]水稻抗稻瘟病基因Pi2的分子標(biāo)記及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410312834.6
• 申請(qǐng)日: 2014-07-03
• 公開（公告）號(hào): CN104073487A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳松彪;王鋒;田大剛;陳在杰;陳子強(qiáng);林艷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)作物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及水稻抗稻瘟病基因Pi2的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

水稻是中國(guó)乃至世界上最重要的糧食作物之一，但其生產(chǎn)遭受稻瘟病嚴(yán)重危害。在世界范圍內(nèi)，由稻瘟菌（Magnapothe?oryzae）引起的稻瘟病常年可造成水稻產(chǎn)量10-30%的損失（Dean等，2005）。長(zhǎng)期的生產(chǎn)實(shí)踐表明，選育和利用抗病水稻品種是防治稻瘟病最有效、最經(jīng)濟(jì)、對(duì)環(huán)境安全的方法。

傳統(tǒng)抗病水稻品種選育，主要依賴于苗期抗性接種表型鑒定或在稻瘟病易發(fā)區(qū)進(jìn)行抗性表型篩選，容易因環(huán)境、氣候等稻瘟發(fā)病條件的變化而受影響，導(dǎo)致鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確，育種效率偏低。此外，不少抗病基因間存在表型上的抗譜重疊性，傳統(tǒng)育種依靠表型選擇，難以鑒定到聚合多抗病基因的持久廣譜抗病品種。

分子標(biāo)記輔助選擇是隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)的發(fā)展而產(chǎn)生的農(nóng)作物育種新技術(shù)。這一技術(shù)主要通過分析與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記基因型，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的選擇。在作物抗病育種中，分子標(biāo)記輔助選擇能夠提高選擇可靠性，加快育種進(jìn)程。此外，基于對(duì)目標(biāo)基因緊密連鎖分子標(biāo)記的檢測(cè)，還能夠?qū)崿F(xiàn)多個(gè)抗病基因聚合，培育持久抗病品種的目標(biāo)。

Pi2基因是一個(gè)抗譜很廣的水稻抗稻瘟病基因。Chen等（2001）以來源于中國(guó)中部和南部稻區(qū)的792個(gè)生理小種接種攜帶Pi2基因的水稻近等基因系C101A51，發(fā)現(xiàn)C101A51對(duì)超過92%的生理小種表現(xiàn)抗性；Liu等（2002）研究表明，攜帶Pi2基因的水稻近等基因系C101A51對(duì)來自13個(gè)國(guó)家的36個(gè)生理小種表現(xiàn)抗性。這些結(jié)果表明Pi2基因在水稻抗稻瘟病育種中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。因此，建立Pi2基因的分子標(biāo)記，對(duì)充分利用該基因培育抗稻瘟病水稻新品種，具有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供水稻抗稻瘟病基因Pi2的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。通過檢測(cè)該分子標(biāo)記，可以準(zhǔn)確判斷所檢測(cè)水稻材料是否具有抗病基因Pi2，顯著提高培育抗稻瘟病水稻品種的效率。

本發(fā)明通過分析抗稻瘟病功能基因Pi2及其上、下游區(qū)間的序列，發(fā)現(xiàn)與其它不含Pi2功能基因水稻品種基因組中等位區(qū)間的序列相比，Pi2功能基因的起始密碼子ATG上游約28.3?kb區(qū)間存在一個(gè)27?bp的插入/缺失位點(diǎn)，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；同時(shí)，Pi2功能基因的終止密碼子TGA下游2236/2237?bp之間存在一個(gè)53?bp的插入/缺失位點(diǎn)，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種水稻抗稻瘟病基因Pi2的分子標(biāo)記，分為上游分子標(biāo)記和下游分子標(biāo)記，分別針對(duì)核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示的特異性插入/缺失位點(diǎn)多態(tài)。

所述的水稻抗稻瘟病基因Pi2的分子標(biāo)記的引物組合Pi2U-F/Pi2U-R，由如SEQ?ID?NO.3所示的DNA序列和如SEQ?ID?NO.4所示的DNA序列組成，用于擴(kuò)增上游分子標(biāo)記。

所述的水稻抗稻瘟病基因Pi2的分子標(biāo)記的引物組合Pi2D-F/Pi2D-R，由如SEQ?ID?NO.5所示的DNA序列和如SEQ?ID?NO.6所示的DNA序列組成，用于擴(kuò)增下游分子標(biāo)記。

根據(jù)上述引物組合，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)水稻抗稻瘟病功能基因Pi2的分子標(biāo)記的方法，包括以下步驟：

1）提取水稻樣品基因組DNA；

2）利用權(quán)利要求3所述的引物組合Pi2U-F/Pi2U-R和權(quán)利要求4所述的引物組合Pi2D-F/Pi2D-R對(duì)水稻樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)Pi2U-F/Pi2U-R的擴(kuò)增產(chǎn)物是否為一條144?bp條帶，并且Pi2D-F/Pi2D-R的擴(kuò)增產(chǎn)物是否為一條195?bp條帶，判斷所檢測(cè)水稻樣品基因組是否具有水稻抗稻瘟病基因Pi2，即如果利用Pi2U-F/Pi2U-R和Pi2D-F/Pi2D-R能夠分別擴(kuò)增出一個(gè)144?bp和195?bp的標(biāo)記片段，則標(biāo)志著該水稻樣品基因組中存在抗稻瘟病基因Pi2。

本發(fā)明另外保護(hù)了一種選育水稻抗稻瘟病品種的方法，包括以下步驟：

1）以含有抗稻瘟病基因Pi2的水稻品種C101A51或其衍生系為親本材料，與其他水稻品種雜交或回交并繁衍后代群體；