[發明專利]一種FRM1基因CGG序列重復的檢測方法及應用

無效

• 申請號: 201410312722.0
• 申請日: 2014-07-03
• 公開（公告）號: CN104059981A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發明（設計）人: 傅詠南;何駿奇;王校
• 申請（專利權）人: 上海中優醫藥高科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種FRM1基因CGG序列重復的檢測方法及應用，其特征在于，其包括如下實現步驟：

設計了兩對引物，內參引物以及檢測引物，一對內參引物位于CGG重復區的5’端；另外一對檢測引物跨越整個CGG重復區；

所述擴增的內參引物序列為：

SEQ NO.1 F：5’-CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC -3’

SEQ NO.2 M：5’-CGCTGCGGGTGTAAACACTGAAACCACGTC -3’

所述擴增的檢測引物序列為：

SEQ NO.3 F1：5’-CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC -3’

SEQ NO.4 R：5’-AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCTCCA -3’。

2.根據權利1所述的FRM1基因序列CGG重復的檢測方法，檢測的引物可以采用相同或不同的熒光染料標記。

3.根據權利要求1 所述的FRM1基因序列CGG重復的檢測方法，其特征在于: 所述方法的具體處理步驟如下：

（1）DNA 提取，取200μL DNA樣本溶液用試劑盒提取DNA，采用核酸分析儀或分光光度計進行DNA濃度及純度鑒定；

（2）反應體系的配置，在每一個反應孔中加入一定的反應體系；

（3）按一定的程序進行擴增；

（4）電泳檢測擴增結果。

4. 根據權利要求3 所述的FRM1基因序列CGG重復的檢測方法，其特征在于：所述步驟（2）反應體系如下：

10×擴增緩沖液 5.0 ul；25mM Mg²⁺ 4.0 ul；10mM dATP 1.0 ul；10mM dTTP 1.0 ul；10mM dCTP 1.0 ul；10mM dGTP 1.0 ul；10mM 7-deza-dGTP 2.0 ul；二甲亞砜 3.0 ul；引物（SEQ NO.1 20 pmol/ul） 1.5 ul；引物（SEQ NO.2 20 pmol/ul） 1.0 ul；引物（SEQ NO.3 20 pmol/ul） 2.0 ul；無菌水 30.0 ul；模板DNA（10 ng/ul）2.0 ul。

5. 根據權利要求3 所述的檢測FRM1基因序列CGG重復的檢測方法，其特征在于：所述步驟（3）

按以下程序進行擴增：

95℃ 10min；

80℃ 8min；

向每個反應孔中加入5.0U的DNA擴增酶；

95℃ 45sec → 58℃ 1min → 72℃ 4min，10 個循環；

95℃ 15sec → 58℃ 1min → 72℃ 5min，20 個循環。

6. 根據權利要求3 所述的檢測FRM1基因序列CGG重復的檢測方法，其特征在于：所述電泳檢測擴增結果步驟如下：配1.5% 瓊脂糖凝膠，取9μL 擴增的產物與10 倍濃度上樣緩沖液混勻后上樣，120V 電泳30min，紫外判斷PCR 結果。

7. 根據權利要求3 所述的檢測FRM1基因序列CGG重復的檢測方法，其特征還在于通過凝膠電泳、毛細電泳等電泳方法分析樣本中FRM1基因序列CGG重復和拷貝數。

8. 根據權利要求3 所述的檢測FRM1基因序列CGG重復的檢測方法，其特征在于：結果判讀的標準如下

（1）在同一泳道出現兩條條帶，一條條帶大小在DNA標記220bp處，另一條條帶大小在DNA標記220bp和640bp之間，則表明樣本的CGG序列重復數小于54，樣本結果為正常；

（2）在同一泳道出現兩條條帶，一條條帶大小在DNA標記220bp處，另一條條帶大小在DNA標記640bp和1077bp之間，則表明樣本的CGG序列重復數在54和200之間，樣本結果為前突變；

（3）在同一泳道出現一條條帶，這條條帶大小在DNA標記220bp處；樣本結果為全突變；

（4）在同一泳道未任何條帶出現時，表明DNA提取出現問題，需要重新進行試驗。

9. 根據權利要求1 ～ 8任一項所述的檢測方法在檢測FRM1基因序列CGG序列重復數中應用。