[發(fā)明專利]一種用適配體-懸浮芯片檢測凝血酶的試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410310023.2
• 申請日: 2014-06-30
• 公開（公告）號(hào): CN104034712A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉楠;高志賢;劉亞楠;馬新華;李曉麗;歐國榮
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測凝血酶的試劑盒。?

背景技術(shù)

凝血酶是人體凝血系統(tǒng)中衡量凝血功能的重要指標(biāo)，也是一些腫瘤患者血凝機(jī)制改變、腦出血等重大疾病診斷、治療的生物標(biāo)志物，它的濃度及活性是衡量人體凝血機(jī)制功能正常與否的重要指標(biāo)，對早期診斷、療效監(jiān)測及預(yù)后判斷具有重要意義。?

核酸適配體，即寡核苷酸適配體，能夠與轉(zhuǎn)移配體特異結(jié)合的單鏈寡核苷酸序列，。通常是有20-60nt核苷酸組成的RNA或單鏈DNA。適配體與靶標(biāo)物的特異結(jié)合是由于單鏈核酸空間構(gòu)象的多樣性。靶標(biāo)物存在時(shí)，單鏈核酸由于靜電作用、氫鍵作用、某些堿基配對等，自身發(fā)生折疊，形成穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)，如假結(jié)、發(fā)卡、G-四分體和凸環(huán)等。現(xiàn)在已經(jīng)篩選出用于識(shí)別蛋白質(zhì)、重金屬離子、氨基酸和小分子毒素等的適配體。核酸適配體被人們比喻為“化學(xué)抗體”。核酸適配體易于制備和成本較抗體低的優(yōu)勢越來越成為一種理想的抗體替代物。研究表明，核酸適配體與靶標(biāo)物的靶點(diǎn)之間親和力比抗體更高，而且核酸適配體主要通過PCR技術(shù)篩選和合成，生產(chǎn)成本較抗體大大降低，也因此具有不受免疫條件和免疫原性限制，可體外人工合成，變性與復(fù)性可逆，可修飾并易于長期保存和室溫運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)；核酸適配體良好的特異性，可以很好解決多種抗原抗體之間存在交叉反應(yīng)干擾的難題。?

懸浮芯片技術(shù)整合了流式細(xì)胞技術(shù)與熒光微球技術(shù)的優(yōu)勢，將有色微球、激光技術(shù)、應(yīng)用流體學(xué)、高速數(shù)字信號(hào)技術(shù)和計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則相結(jié)合，提高了檢測特異性和靈敏度，具有重復(fù)性與穩(wěn)定性好、檢測指標(biāo)可靈活選擇以及高靈敏度與高信噪比等諸多優(yōu)點(diǎn)；在進(jìn)行多樣本，如血清或者其他生物樣品的檢測，樣品量僅需要μL到數(shù)十μL。?

傳統(tǒng)測定凝血酶的試劑盒主要有發(fā)色底物和酶聯(lián)免疫吸附試劑盒等，這些試劑盒簡單易行，但靈敏度不夠高，不宜進(jìn)行微量分析。熒光法是將熒光底物與凝血酶結(jié)合，通過測定熒光強(qiáng)度可以得出凝血酶的含量，單純使用熒光法需要用熒光底物標(biāo)記凝血酶，操作步驟繁瑣，熒光背景不易降低，靈敏度低。針對以上問題，建立一種檢測凝血酶的適配體-懸浮芯片試劑盒，實(shí)現(xiàn)對人血清樣本中凝血酶快速、準(zhǔn)確、特異和高效的定量檢測，目前并未見相關(guān)類似報(bào)道。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用適配體-懸浮芯片檢測凝血酶的試劑盒。?

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：?

一種用適配體-懸浮芯片檢測凝血酶的試劑盒，包括：?

A試劑：用下述方法制成：第一適配體的5′端依次連接有6個(gè)(CH₂)和氨基后，與羧?基化熒光磁性編碼微球在pH＝8.0的100×稀釋的TE緩沖液中，通過氨基-羧基進(jìn)行偶聯(lián)得到捕獲探針液體；所述捕獲探針液體中捕獲探針的濃度為2000個(gè)/μL；所述第一適配體序列用SEQ?ID?NO.1所示；?

B試劑：用下述方法制成：用含0.005M?MgCl₂、濃度為0.01M的pH＝7.4磷酸鹽緩沖液稀釋5′端生物素化的第二適配體至1μM；所述第二適配體序列用SEQ?ID?NO.2所示；?

C系列試劑：濃度為0、1、1.75、3.5、7、14、28、56、90、112.5、225、450和900nM的凝血酶水溶液；?

D試劑：用下述方法制成：用pH＝7.4的濃度為0.01M的磷酸鹽緩沖液為溶劑配制濃度為10μg/mL鏈霉親和素-藻紅蛋白溶液。?

優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的試劑盒能對凝血酶快速、準(zhǔn)確、高效的定量檢測，為臨床提供早期診斷治療的依據(jù)，并可進(jìn)一步發(fā)展應(yīng)用于臨床上大規(guī)模血清樣本的檢測。?

附圖說明

圖1為本發(fā)明的試劑盒檢測凝血酶模式圖。?

圖2為凝血酶檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。?

A圖為凝血酶濃度為7-56nM時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；?

B圖為凝血酶濃度為56-900nM時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；?

MFI為凝血酶濃度為0、1、1.75、3.5、7、14、28、56、90、112.5、225和450nM檢測所獲得的系列有效中位熒光強(qiáng)度值；?

MFI₀為凝血酶濃度為900nM時(shí)所獲得的有效陽性中位熒光強(qiáng)度值；?

具體實(shí)施方式

羧基化熒光磁性編碼微球(Luminex公司，美國)?

人α-凝血酶(Enzyme?Research?Laboratories，美國，本發(fā)明各實(shí)施例采用的是人α-凝血酶)?

人血清標(biāo)準(zhǔn)樣品(不含凝血酶，中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京)?