[發(fā)明專(zhuān)利]利用miRNA827基因預(yù)報(bào)水稻白葉枯病的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410309695.1
• 申請(qǐng)日: 2014-06-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104141005A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王沁;張繼;彭海
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江漢大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京三高永信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11138
• 代理人: 徐立

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及利用miRNA827基因預(yù)報(bào)水稻白葉枯病的方法。

背景技術(shù)

水稻是我國(guó)主要糧食作物，白葉枯病是水稻兩大主要病害之一，屬世界性病害，亞洲稻區(qū)發(fā)生尤重。白葉枯病發(fā)病率高、傳染快，發(fā)病稻田減產(chǎn)20-30％，甚至50％。與大部分病害一樣，白葉枯病發(fā)病早期防治效果較佳。發(fā)病中后期，病菌已大量繁殖，已對(duì)水稻造成了傷害，防治效果較差。由此可見(jiàn)，早期預(yù)報(bào)是水稻白葉枯病預(yù)防的關(guān)鍵所在。

傳統(tǒng)水稻白葉枯病預(yù)報(bào)主要依據(jù)氣候、天氣、品種抗性、氮肥施用情況、以及病害歷史等進(jìn)行推測(cè)，也可依據(jù)田間水稻白葉枯病癥狀表現(xiàn)，對(duì)后期病情發(fā)展進(jìn)行預(yù)報(bào)。

在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的過(guò)程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問(wèn)題：

根據(jù)天氣、氣候、品種抗性、栽培現(xiàn)狀和歷史等進(jìn)行的預(yù)報(bào)結(jié)果是很模糊的，可說(shuō)明在一定區(qū)域與時(shí)間范圍內(nèi)病害發(fā)生的概率，但不能預(yù)報(bào)病害發(fā)生的具體時(shí)間與地點(diǎn)，預(yù)報(bào)結(jié)果的可應(yīng)用性較差。例如，高溫高濕常作為水稻白葉枯病的流行預(yù)報(bào)的氣候條件，但不能確定高溫高濕下病害是否一定出現(xiàn)、在那塊田出現(xiàn)、在那天出現(xiàn)。由于以上的不確定性，農(nóng)民不能決定是否開(kāi)始防治白葉枯、對(duì)哪塊田進(jìn)行防治、以及何時(shí)防治。同時(shí)，病癥出現(xiàn)表明白葉枯病已進(jìn)入中后期，病菌已大量繁殖，白葉枯病流行已難以避免，使得利用病癥調(diào)查進(jìn)行預(yù)報(bào)的工作也無(wú)太大實(shí)際意義。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中水稻白葉枯病預(yù)報(bào)不及時(shí)、不準(zhǔn)確的缺點(diǎn)，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種利用miRNA827基因預(yù)報(bào)水稻白葉枯病的方法。所述技術(shù)方案如下：

選取9311/Xa23水稻品種作為待測(cè)水稻和對(duì)照水稻；

栽培所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻；

分別分離所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻中的總miRNA基因；

分別檢測(cè)所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻中的所述總miRNA基因中的miRNA827基因的表達(dá)量，所述miRNA827基因的序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示；

根據(jù)所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻中的miRNA827基因的表達(dá)量，判定實(shí)驗(yàn)是否成功，若成功，則進(jìn)一步判定所述待測(cè)植株是否感染白葉枯病。

具體地，所述栽培所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻時(shí)，所述對(duì)照水稻在栽培時(shí)采用保護(hù)性栽培措施并防治白葉枯病，除所述保護(hù)性栽培措施和防治白葉枯病外，所述對(duì)照水稻與所述待測(cè)水稻的栽培條件保持一致。

進(jìn)一步地，所述保護(hù)性栽培措施包括對(duì)土壤隔離、水源隔離和空間隔離。

具體地，在上午8：55～9：05利用所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻的相同葉片的相同部位進(jìn)行所述總miRNA基因的分離。

具體地，采用實(shí)時(shí)定量PCR方法，檢測(cè)所述miRNA827基因在所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻中的表達(dá)量。

進(jìn)一步地，所述實(shí)時(shí)定量PCR方法的前處理步驟包括：

利用分光光度計(jì)測(cè)定并獲得分離的所述總miRNA基因的濃度；

向所述總miRNA基因中加入外源參考miRNA基因，得到第一混合液，所述外源參考miRNA基因的加入量為所述總miRNA基因質(zhì)量的0.05％，所述外源參考miRNA基因的序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示；

將所述總miRNA基因和所述外源參考miRNA基因的5’端與3’端連接，得到環(huán)化的所述總miRNA基因和環(huán)化的所述外源參考miRNA基因的混合液；

將所述環(huán)化的總miRNA基因和所述環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于進(jìn)行所述實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。

進(jìn)一步地，所述采用實(shí)時(shí)定量PCR方法，檢測(cè)所述miRNA827基因在所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻中的表達(dá)量，包括：

將2μl所述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、3μl濃度為1μM的引物、10μl定量PCR混合物和0.4μl50倍的ROX熒光校正染料混合均勻，得到第二混合液，將所述第二混合液在實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，所述反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃2分鐘；95℃10分鐘；95℃45秒，56℃45秒，66℃30秒，67℃30秒，共45個(gè)循環(huán)，其中，66℃30秒和67℃30秒這兩步在每循環(huán)一次后分別增加0.1℃和0.2℃，在每一次循環(huán)的最后一步收集熒光信號(hào)，所述熒光信號(hào)的強(qiáng)弱用于衡量所述表達(dá)量的多少；