[發明專利]來自冬蟲夏草的絲氨酸蛋白酶、編碼基因及其應用

有效

• 申請號: 201410308921.4
• 申請日: 2014-06-30
• 公開（公告）號: CN104130994B
• 公開（公告）日: 2017-01-04
• 發明（設計）人: 柳志強;鄭裕國;林善;薛亞平;吳暉;李邦良;許靜;許峰;王鴻艷
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學;杭州中美華東制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/58
• 分類號: C12N9/58;C12N15/57;C12N1/21;C12P13/22;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司33201
• 代理人: 黃美娟,李世玉

(一)技術領域

本發明涉及來自“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢的絲氨酸蛋白酶、編碼基因及其應用。

(二)背景技術

冬蟲夏草(Cordyceps?sinensis(Berk.)Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(Hepialus?armoricanus?Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸體上的復合體(包括子座和蟲體)。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統真菌藥材資源，具有代謝產物和生物活性多樣的特點，在生物醫藥領域展現出巨大的應用和發展前景。冬蟲夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關注，在世界范圍內備受推崇。中醫認為，冬蟲夏草入肺腎二經，既能補肺陰，又能補腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調節陰陽的中藥。現代藥理學已證實，冬蟲夏草具有免疫調節、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。

冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人工培養、液體發酵等實際生產中使用的是無性階段的冬蟲夏草菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國內外學者在冬蟲夏草資源調查、無性型確證、活性成分分離分析和作用機理、開發應用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國被毛孢已被證明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。

但是，對冬蟲夏草中國被毛孢機制機理的研究幾乎為空白，尤其在中國被毛孢侵染蝙蝠蛾幼蟲的機制機理上，以及對絲氨酸蛋白酶在中國被毛孢侵染機制中的作用的研究。

絲氨酸蛋白酶廣泛存在于動物、植物、細菌、病毒、真菌中，并且參與生命的各種反應，比如蛋白質翻譯后后加工、細胞分裂、病原體感染、組織降解、細胞凋亡等，可見絲氨酸蛋白酶具有廣泛的研究和應用價值。

絲氨酸蛋白酶是一類以絲氨酸為活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有機體中起著重要而廣泛的生理作用，還在胚胎發育、組織重建、細胞分化、血管形成和病原侵入等過程中都發揮著重要的作用。絲氨酸蛋白酶超家族的成員多而廣，它們的活性部位都含Ser、His、Asp，并具有相同的催化機制，但是它們與底物結合部位的差異決定了各自對底物的專一性。

絲氨酸蛋白酶在結構上為全β蛋白，核心結構由兩個非常相似的結構域(N結構域和C結構域)構成。由于兩個結構域在結構上存在著差異，它們在功能和進化上的作用也就不同。

1986年，Gershenfeld?HK等人在《Science》上發表論文，他們通過RNA雜交競爭協議從小鼠的細胞毒性T淋巴細胞互補DNA文庫中分離出的克隆可以編碼一個新的絲氨酸蛋白酶，并且對它進行了克隆，該基因的堿基序列編碼約為25700道爾頓的氨基酸序列，25％至35％屬于絲氨酸蛋白酶家族，保守的活性位點殘基為His57，Asp102和Ser195的胰凝乳蛋白酶。Southern雜交分析表明，這個基因在人類，小鼠和雞種保守。此絲氨酸蛋白酶可能在淋巴細胞的裂解和溶解級聯有作用。

1999年，Kyoko?Yamashiroa等人從人結腸腺癌細胞中克隆到了一個新的絲氨酸蛋白酶，該序列包括155bp的5’非編碼區和一個位于551bp的3’非編碼區后的732bp長的開放閱讀框非編碼區，預測的蛋白由244個氨基酸組成，和絲氨酸蛋白酶家族的其他成員顯示一定的相似性，和發現的其他類似胰蛋白酶一樣，這種酶含有作為必要的氨基酸殘基的活性的催化三聯體。

2003年，李文輝等人利用逆轉錄酶與聚合酶鏈反應相結合的RT-PCR法，擴增出5個竹葉青(Trimeresurus?stejnegeri)蛇毒絲氨酸蛋白酶的cDNAs，將擴增的cDNA片段克隆入pGEM-T載體中，再經末端終止法測定核苷酸序列，推導出5個絲氨酸蛋白酶的全序列。5個絲氨酸蛋白酶分別含有1-6個N-型糖基結合位點，表明它們的計算分子量與純化蛋白表觀分子量之間的差異是由糖含量的不同造成，而其氨基酸序列相似度在60％-90％。

2004年，儲衛華等人根據已發表的氣單胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列，設計和合成了一對引物，以嗜水氣單胞菌AhJ-1的基因組DNA為模板，通過PCR技術，擴增到約900bp的絲氨酸蛋白酶基因片段，并克隆到質粒載體pGEM-T中進行測序和分析，結果表明擴增的絲氨酸蛋白酶基因片段與已發表的嗜水氣單胞菌絲氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87％，擴增片段編碼343個氨基酸，推測的分子量為35700，計算機軟件分析表明編碼的氨基酸有較高的抗原性，可作為核酸疫苗的侯選基因片段。