[發明專利]冬蟲夏草酯酶/脂肪酶、編碼基因、載體、工程菌及其應用

有效

• 申請號: 201410308598.0
• 申請日: 2014-06-30
• 公開（公告）號: CN104130987A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 柳志強;鄭裕國;林善;薛亞平;吳暉;李邦良;許靜;許峰;王鴻艷
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學;杭州中美華東制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N9/16;C12P7/40;C12N15/55;C12P7/62;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

(一)技術領域

本發明涉及一個來自冬蟲夏草中國被毛孢中一種酯酶/脂肪酶基因、含有該基因的重組載體、該重組載體轉化得到的重組基因工程菌，本發明還涉及所述的酯酶/脂肪酶基因及重組酯酶/脂肪酶在制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應用。

(二)背景技術

冬蟲夏草(Cordyceps?sinensis(Berk.)Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(Hepialus?armoricanus?Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸體上的復合體(包括子座和蟲體)。冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人工培養、液體發酵等實際生產中使用的是無性階段的冬蟲夏草菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國內外學者在冬蟲夏草資源調查、無性型確證、活性成分分離分析和作用機理、開發應用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國被毛孢已被證明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。

酯酶(Esterase，EC3.1.1.1)是一類能催化酯水解和合成的酶，可在水分子的參與下，經由水解作用，將酯類切割成酸類與醇類,由于酯酶催化的酶促反應具有良好的底物專一性、區域選擇性或對映選擇性，酯酶被廣泛用于手性拆分中，是合成手性酸、手性酯或手性醇等手性化合物的重要生物催化劑。

脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。水解生成的脂肪酸，可以用標準的堿溶液滴定，以滴定值表示酶活力。脂肪酶基本組成單位僅為氨基酸，通常中有一條多肽鏈。它的催化活性僅僅決定于它的蛋白質結構。脂肪酶在微生物中有廣泛的分布，其產生菌主要四霉菌和細菌。脂肪酶的性質研究主要包括最適溫度與pH、溫度與pH穩定性、底物特異性等幾個方面。迄今，已分離、純化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性質，它們在分子量、最適pH、最適溫度、pH和熱穩定性、等電點和其他生化性質方面存在不同。

有研究表明，豬肝酯酶(PLE)在Pichia?pastoris中成功得到過表達,因此可以很好地獲取高純度的重組PLE。而且PLE在水解乙酸仲醇酯時，顯示出更好的對映選擇性，在水解(R,S)-1-苯基-2-丁基乙酸酯時，利用商品化的PLE得到的對映選擇率E<4，而用重組的PLE得到的E>100。

普瑞巴林(Pregabalin，簡稱PGB)，化學名為(S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸，是γ-氨基丁酸的一種結構類似物。普瑞巴林作為一種鈣離子通道調節劑，能有效阻斷電壓依賴性鈣通道，減少神經遞質的釋放，對癲癇、神經病理性疼痛有良好的療效，與傳統藥物相比具有使用劑量低、服用次數少、副作用小、持續時間長、耐受性強等特點。因此被國際疼痛學會(IASP)、歐洲神經病學學會聯盟(EFNS)和英國NICE等多個國際指南推薦位一線治療藥物，具有廣闊的市場應用前景。

(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸是制備普瑞巴林的關鍵手性中間體，可由2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制備，但其原子經濟性較低，以外消旋3-氰基-5-甲基己酸乙酯位底物，通過酶法對其進行選擇性水解合成普瑞巴林的關鍵手性中間體(S)-3-氰基-5-甲基己酸，建立綠色、高效的普瑞巴林合成工藝。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種從冬蟲夏草中國被毛孢(Hirsutella?sinensis)L0106(該菌種保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?No：M2011278，已在先前申請的專利CN102373190A中披露)中獲得的酯酶/脂肪酶、編碼基因、含有該基因的重組載體、該重組載體轉化得到的基因工程菌，及其在制備普瑞巴林的關鍵手性中間體(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的應用。

本發明采用的技術方案是：

本發明提供一種來源于冬蟲夏草中國被毛孢(Hirsutella?sinensis)L0106的酯酶/脂肪酶，所述酯酶/脂肪酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO.2(記為Lip8)所示。

所述SEQ?ID?NO.2所示氨基酸序列為：

401??R*