[發明專利]抗豬紅細胞CR1-like單克隆抗體及其制備有效

申請號：	201410308534.0	申請日：	2014-07-01
公開（公告）號：	CN104164407B	公開（公告）日：	2017-01-11
發明（設計）人：	李宏全;姜俊兵;馬海利;孫耀貴;崔嬌艷;尹偉;范闊海;王治維;孫娜;趙昕	申請（專利權）人：	山西農業大學
主分類號：	C12N5/20	分類號：	C12N5/20;C07K16/18;G01N33/577;A61K39/395;A61P37/06;C12R1/91
代理公司：	太原華弈知識產權代理事務所14108	代理人：	李毅
地址：	030801 山***	國省代碼：	山西;14
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摘要：
搜索關鍵詞：	紅細胞 cr1 like 單克隆抗體及其制備
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種單克隆抗體，具體涉及一種抗豬紅細胞CR1-like單克隆抗體，以及該單克隆抗體的制備，本發明還涉及分泌該抗豬紅細胞CR1-like單克隆抗體的雜交瘤細胞株。?

背景技術

自美國學者Siegel等在1981年提出“紅細胞免疫系統(Red?cell?immune?system，RCIS)”概念以來，人們逐漸認識到紅細胞不僅具有在血液中攜帶氧氣的呼吸功能和調節血液pH值的緩沖功能，還具有免疫功能，并包含完整的自我調控系統。目前，人類醫學領域中有關紅細胞免疫的研究已經非常深入，紅細胞在體內廣泛參與特異性與非特異性免疫、機體免疫調控，并影響多種疾病的發生、發展，而CR1是人紅細胞免疫功能最重要的物質基礎。?

人CR1是一種存在于紅細胞、淋巴細胞、白細胞表面的相對分子質量205kDa的單鏈糖蛋白，其在每個紅細胞上的數量為950，以散在和集簇狀態分布在細胞膜上。人紅細胞上有50%的CR1呈集簇分布，而其他細胞上CR1的集簇分布率卻小于15%，紅細胞CR1的這種集簇分布方式可使它與C3b包被的免疫復合物的結合位點呈多價性，且連接更為牢固。由于血液循環中絕大多數的CR1存在于紅細胞膜上，紅細胞清除血液循環免疫復合物的幾率比白細胞大500-1000倍，因此，以CR1基礎的紅細胞免疫黏附是人紅細胞最重要的免疫功能。當人紅細胞對免疫復合物的結合受到限制時，免疫復合物就會沉積在敏感組織中，導致許多疾病的發生。?

目前的研究證實，多種哺乳動物、嚙齒類動物、禽類紅細胞具有免疫粘附功能，但并未證實CR1是動物紅細胞唯一的免疫粘附受體，也未見有特異性阻斷這種免疫粘附的研究報告，更未從動物紅細胞膜上獲得過粘附受體并證明其蛋白質特性。豬作為我國飼養量最大的家畜和人類醫學和生物醫學工程領域最常用的模型動物，對豬紅細胞CR1-like功能的研究，將有可能提高和改善豬養殖和疾病治療的現狀，并為其他動物紅細胞免疫粘附的研究提供借鑒，也將為人類開展以CR1為靶點的疾病治療和藥物研發提供研究基礎。?

由于對豬紅細胞CR1-like研究缺乏有效的試驗工具，特別是抗豬紅細胞CR1-like的特異性抗體，使得豬紅細胞CR1-like研究進展較為緩慢。因此，提供一種抗豬紅細胞CR1-like的單克隆抗體，對進一步研究豬紅細胞CR1-like具有重要意義。?

發明內容

本發明的目的是提供一種分泌特異性識別豬紅細胞CR1-like的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，以及上述雜交瘤細胞株分泌的抗豬紅細胞CR1-like單克隆抗體。?

本發明提供了一株抗豬紅細胞CR1-like單克隆抗體的雜交瘤細胞株，所述雜交瘤細胞株命名為CR-M01，于2014年6月6日保藏于中國典型培養物保藏中心（CCTCC），地址：中國武漢市武昌珞珈武漢大學，郵編430072。保藏號為CCTCC?NO:C201475。?

本發明所述的雜交瘤細胞株是通過雜交瘤技術，以合成的多肽作為免疫原建立的。?

本發明還提供了由所述雜交瘤細胞株CR-M01分泌的抗豬紅細胞CR1-like單克隆抗體，所述單克隆抗體的亞型為IgG1。?

所述單克隆抗體純化后，經western?blot和免疫熒光染色，證明其能夠特異性識別豬紅細胞CR1-like蛋白。?

進而，本發明所述抗豬紅細胞CR1-like單克隆抗體能夠特異性的阻斷豬紅細胞的免疫粘附作用。?

本發明提供的抗豬紅細胞CR1-like單克隆抗體的制備方法包括如下步驟：?

1?抗原制備

對GenBank登錄的豬紅細胞CR1-like基因進行分析，選取CDS區翻譯出相應的蛋白質序列，分析蛋白質序列二級結構，獲得以下抗原位點pep：NSFWSIPEGNCKRKT。將抗原位點合成多肽，多肽分別偶聯KLH和BSA，其中KLH-pep用于小鼠免疫，BSA-pep用于ELISA后期篩選。

2?動物免疫?