[發明專利]冬蟲夏草3-異丙基蘋果酸脫氫酶A、編碼基因及其應用

有效

• 申請號: 201410307409.8
• 申請日: 2014-06-30
• 公開（公告）號: CN104120114A
• 公開（公告）日: 2014-10-29
• 發明（設計）人: 柳志強;鄭裕國;林善;薛亞平;吳暉;李邦良;許靜;許峰;王鴻艷
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學;杭州中美華東制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12P7/40;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

(一)技術領域

本發明涉及來自“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢的3-異丙基蘋果酸脫氫酶A(3-isopropylmalate?dehydrogenase)、編碼基因及其應用。

(二)背景技術

冬蟲夏草(Cordyceps?sinensis(Berk.)Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(Hepialus?armoricanus?Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸體上的復合體(包括子座和蟲體)。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統真菌藥材資源，具有代謝產物和生物活性多樣的特點，在生物醫藥領域展現出巨大的應用和發展前景。冬蟲夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關注，在世界范圍內備受推崇。中醫認為，冬蟲夏草入肺腎二經，既能補肺陰，又能補腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調節陰陽的中藥。現代藥理學已證實，冬蟲夏草具有免疫調節、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。

冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人工培養、液體發酵等實際生產中使用的是無性階段的冬蟲夏草菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國內外學者在冬蟲夏草資源調查、無性型確證、活性成分分離分析和作用機理、開發應用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國被毛孢已被證明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。

但是，對冬蟲夏草中國被毛孢中3-異丙基蘋果酸脫氫酶A的研究幾乎為空白，以及對3-異丙基蘋果酸脫氫酶A在中國被毛孢中生物催化3-異丙基蘋果酸制備4-甲基-2-氧代戊酸的作用的研究。

3-異丙基蘋果酸脫氫酶(IPMDH,EC:1.1.1.85)是生物合成亮氨酸中的一個關鍵酶，是一種以NAD⁺或NADP+為受體、作用于供體CH-OH基團上的氧化還原酶。這種酶能催化以下酶促反應：此反應實際上由兩步組成：和亦即上述第一步反應的產物可通過第二步反應自發脫羧產生4-甲基-2-氧代戊酸。

1981年，Tanaka等人從極端嗜熱菌Thermus?thermophilus?HB8中克隆到了一個3-異丙基蘋果酸脫氫酶，并且用pBR322作為載體克隆到大腸桿菌中。攜帶重組質粒的大腸桿菌的3-異丙基蘋果酸脫氫酶酶活是野生型菌株的7倍。

1986年，Kazuhiro?Hamasawa等人從產朊假絲的基因文庫中克隆到一個3-異丙基蘋果酸脫氫酶基因，利用質粒pYKL30克隆到大腸桿菌和釀酒酵母中。這個基因的開放讀碼框大小為1089bp，編碼363個氨基酸殘基。Southern雜交證實，該片段是從三產朊假絲而得。

1991年，H?Kirino等人從極端嗜熱菌Thermus?aquaticus?YT-1中克隆到了一個3-異丙基蘋果酸脫氫酶leuB，并且在大腸桿菌中進行了表達，它包含1035bp，編碼344個氨基酸殘基的開放閱讀框。和嗜熱菌T.thermophilus?HB8的3-異丙基蘋果酸脫氫酶的核苷酸序列具有87.0％同源性，氨基酸序列具有91.3％同源性。

1992年，Mats?等人從互補的酵母突變株leu2中克隆到了一個3-異丙基蘋果酸脫氫酶基因，這個基因編碼一個52kDa大小的蛋白，其具有推定的葉綠體轉運肽。在體外由蛋白質導入到葉綠體中，與之同時蛋白裂解。

2011年，Sikdar等人從水稻的基因組中克隆得到了一個3-異丙基蘋果酸脫氫酶基因，該基因的開放讀碼框能編碼389個氨基酸，對應于約41.2kD的蛋白質。這個水稻來源的3-異丙基蘋果酸脫氫酶的氨基酸序列與植物和細菌來源的3-異丙基蘋果酸脫氫酶氨基酸序列高度同源。

但是，目前NCBI數據庫中目前還檢索不到中國被毛孢中3-異丙基蘋果酸脫氫酶A的基因相關信息。

(三)發明內容

本發明目的是針對以上存在的不足和需要解決的技術問題，對“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢3-異丙基蘋果酸脫氫酶A在生物催化3-異丙基蘋果酸制備4-甲基-2-氧代戊酸進行深入研究，提供了“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢的一種3-異丙基蘋果酸脫氫酶A、編碼基因及其應用。

本發明采用的技術方案是：

本發明提供一種來自冬蟲夏草中國被毛孢參與生物催化3-異丙基蘋果酸制備4-甲基-2-氧代戊酸的3-異丙基蘋果酸脫氫酶A，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示(記為isoA蛋白)。