[發(fā)明專利]利用miRNA172b基因的表達預報水稻白葉枯病的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201410307215.8 | 申請日： | 2014-06-30 |
| 公開（公告）號： | CN104131081A | 公開（公告）日： | 2014-11-05 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 覃蕓;方治偉 | 申請（專利權(quán)）人： | 江漢大學 |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 北京三高永信知識產(chǎn)權(quán)代理有限責任公司 11138 | 代理人： | 徐立 |
| 地址： | 430056 湖北省武漢市*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 利用 mirna172b 基因 表達 預報 水稻 白葉枯病 方法 | ||
1.利用miRNA172b基因的表達預報水稻白葉枯病的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
選取9311水稻品種作為待測水稻和對照水稻；
栽培所述待測水稻和所述對照水稻；
分別分離所述待測水稻和所述對照水稻中的總miRNA基因；
分別檢測所述待測水稻和所述對照水稻中的所述總miRNA基因中的miRNA172b基因的表達量，所述miRNA172b基因的序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示；
根據(jù)所述待測水稻和所述對照水稻中的miRNA172b基因的表達量，判定實驗是否成功，若成功，則進一步判斷所述待測植株是否感染白葉枯病。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述栽培所述待測水稻和所述對照水稻時，所述對照水稻在栽培時采用保護性栽培措施并防治白葉枯病，除所述保護性栽培措施和防治白葉枯病外，所述對照水稻與所述待測水稻的栽培條件保持一致。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述保護性栽培措施包括土壤隔離、水源隔離和空間隔離。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在上午8：55～9：05利用所述待測水稻和所述對照水稻的相同葉片的相同部位進行所述總miRNA基因的分離。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用實時定量PCR方法，檢測所述miRNA172b基因在所述待測水稻和所述對照水稻中的表達量。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述實時定量PCR方法的前處理步驟包括：
利用分光光度計測定并獲得分離的所述總miRNA基因的濃度；
向所述總miRNA基因中加入外源參考miRNA基因，得到第一混合液，所述外源參考miRNA基因的加入量為所述總miRNA基因質(zhì)量的0.05％，所述外源參考miRNA基因的序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示；
分別將所述總miRNA基因和所述外源參考miRNA基因的5’端與3’端連接，得到環(huán)化的所述總miRNA基因和環(huán)化的所述外源參考miRNA基因的混合液；
將所述環(huán)化的總miRNA基因和所述環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液進行逆轉(zhuǎn)錄，得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于進行所述實時定量PCR檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述采用實時定量PCR方法，檢測所述miRNA172b基因在所述待測水稻和所述對照水稻中的表達量，包括：
將2μl所述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、3μl濃度為1μM的引物、10μl定量PCR混合物和0.4μl?50倍的ROX熒光校正染料混合均勻，得到第二混合液，將所述第二混合液在實時定量PCR儀中進行反應，所述反應程序為：50℃?2分鐘；95℃?10分鐘；95℃?45秒，56℃?45秒，66℃?30秒，67℃?30秒，共45個循環(huán)，其中，66℃?30秒和67℃?30秒在每循環(huán)一次后分別增加0.1℃和0.2℃，在每一次循環(huán)的最后一步收集熒光信號，所述熒光信號的強弱用于衡量所述表達量的多少；
所述引物包括：序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示的miRNA172b基因正向引物、序列如序列表中SEQ?ID?NO:4所示的miRNA172b基因反向引物、序列如序列表中SEQ?ID?NO:5所示的外部參考miRNA基因正向引物、以及序列如序列表中SEQ?ID?NO:6所示的外部參考miRNA基因反向引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，將所述環(huán)化的總miRNA基因和所述環(huán)化的外部參考miRNA基因的混合液進行逆轉(zhuǎn)錄的步驟包括：
取所述環(huán)化的總miRNA基因和環(huán)化的外部參考miRNA基因的混合液2μl、5μl濃度為1μM的逆轉(zhuǎn)錄引物、2μl濃度為10mM的dNTP、5μl濃度為100mM的DTT和20U的逆轉(zhuǎn)錄酶，用水補足50μl混勻后，得到第四混合液，將所述第四混合液于42℃保溫2小時，75℃保溫15分鐘，使酶失活，得到所述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；所述逆轉(zhuǎn)錄引物包括miRNA172b基因的逆轉(zhuǎn)錄引物和外部參考miRNA基因的逆轉(zhuǎn)錄引物，所述miRNA172b基因的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如序列表中SEQ?ID?NO:7所示，所述外部參考miRNA基因的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如序列表中SEQ?ID?NO:8所示。
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