[發(fā)明專利]冬蟲夏草3-異丙基蘋果酸脫氫酶C、編碼基因及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410306498.4
• 申請日: 2014-06-30
• 公開（公告）號: CN104120113A
• 公開（公告）日: 2014-10-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柳志強(qiáng);鄭裕國;林善;薛亞平;吳暉;李邦良;許靜;許峰;王鴻艷
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué);杭州中美華東制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/40;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢的3-異丙基蘋果酸脫氫酶C(3-isopropylmalate?dehydrogenase)、編碼基因及其應(yīng)用。

(二)背景技術(shù)

冬蟲夏草(Cordyceps?sinensis(Berk.)Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(Hepialus?armoricanus?Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸體上的復(fù)合體(包括子座和蟲體)。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統(tǒng)真菌藥材資源，具有代謝產(chǎn)物和生物活性多樣的特點(diǎn)，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用和發(fā)展前景。冬蟲夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關(guān)注，在世界范圍內(nèi)備受推崇。中醫(yī)認(rèn)為，冬蟲夏草入肺腎二經(jīng)，既能補(bǔ)肺陰，又能補(bǔ)腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時(shí)平衡、調(diào)節(jié)陰陽的中藥。現(xiàn)代藥理學(xué)已證實(shí)，冬蟲夏草具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。

冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人工培養(yǎng)、液體發(fā)酵等實(shí)際生產(chǎn)中使用的是無性階段的冬蟲夏草菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國內(nèi)外學(xué)者在冬蟲夏草資源調(diào)查、無性型確證、活性成分分離分析和作用機(jī)理、開發(fā)應(yīng)用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國被毛孢已被證明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。

但是，對冬蟲夏草中國被毛孢中3-異丙基蘋果酸脫氫酶C的研究幾乎為空白，以及對3-異丙基蘋果酸脫氫酶C在中國被毛孢中生物催化3-異丙基蘋果酸制備4-甲基-2-氧代戊酸的作用的研究。

3-異丙基蘋果酸脫氫酶(IPMDH,EC:1.1.1.85)是生物合成亮氨酸中的一個關(guān)鍵酶，是一種以NAD⁺或NADP⁺為受體、作用于供體CH-OH基團(tuán)上的氧化還原酶。這種酶能催化以下酶促反應(yīng)：(2R,3S)-3-異丙基蘋果酸+NAD⁺4-甲基-2-氧代戊酸+CO₂+NADH+H⁺，此反應(yīng)實(shí)際上由兩步組成：(2R,3S)-3-異丙基蘋果酸+NAD⁺(2S)-2-異丙基-3-氧代琥珀酸+NADH+H⁺和(2S)-2-異丙基-3-氧代琥珀酸4-甲基-2-氧代戊酸+CO₂，亦即上述第一步反應(yīng)的產(chǎn)物可通過第二步反應(yīng)自發(fā)脫羧產(chǎn)生4-甲基-2-氧代戊酸。

1981年，Tanaka等人從極端嗜熱菌Thermus?thermophilus?HB8中克隆到了一個3-異丙基蘋果酸脫氫酶，并且用pBR322作為載體克隆到大腸桿菌中。攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌的3-異丙基蘋果酸脫氫酶酶活是野生型菌株的7倍。

1986年，Kazuhiro?Hamasawa等人從產(chǎn)朊假絲的基因文庫中克隆到一個3-異丙基蘋果酸脫氫酶基因，利用質(zhì)粒pYKL30克隆到大腸桿菌和釀酒酵母中。這個基因的開放讀碼框大小為1089bp，編碼363個氨基酸殘基。Southern雜交證實(shí)，該片段是從三產(chǎn)朊假絲而得。

1991年，H?Kirino等人從極端嗜熱菌Thermus?aquaticus?YT-1中克隆到了一個3-異丙基蘋果酸脫氫酶leuB，并且在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，它包含1035bp，編碼344個氨基酸殘基的開放閱讀框。和嗜熱菌T.thermophilus?HB8的3-異丙基蘋果酸脫氫酶的核苷酸序列具有87.0％同源性，氨基酸序列具有91.3％同源性。

1992年，Mats等人從互補(bǔ)的酵母突變株leu2中克隆到了一個3-異丙基蘋果酸脫氫酶基因，這個基因編碼一個52kDa大小的蛋白，其具有推定的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。在體外由蛋白質(zhì)導(dǎo)入到葉綠體中，與之同時(shí)蛋白裂解。

2011年，Sikdar等人從水稻的基因組中克隆得到了一個3-異丙基蘋果酸脫氫酶基因，該基因的開放讀碼框能編碼389個氨基酸，對應(yīng)于約41.2kD的蛋白質(zhì)。這個水稻來源的3-異丙基蘋果酸脫氫酶的氨基酸序列與植物和細(xì)菌來源的3-異丙基蘋果酸脫氫酶氨基酸序列高度同源。

但是，目前NCBI數(shù)據(jù)庫中目前還檢索不到中國被毛孢中3-異丙基蘋果酸脫氫酶C的基因相關(guān)信息。

(三)發(fā)明內(nèi)容