[發明專利]一種亮氨酸脫氫酶和編碼該脫氫酶的基因

在審

• 申請號: 201410306060.6
• 申請日: 2014-06-30
• 公開（公告）號: CN104031892A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發明（設計）人: 李鑫;姜婷;歐陽嘉;勇強;余世袁;徐勇;鄭兆娟;朱均均;孫秀程;莫逸仙
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

1.一種亮氨酸脫氫酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

2.編碼權利要求1所述亮氨酸脫氫酶的基因，其堿基序列如SEQ?ID?NO.1所示。

3.一種重組質粒，其特征在于，它含有權利要求2所述的亮氨酸脫氫酶基因。

4.一種重組菌，其特征在于，它包含權利3所述的重組質粒。

5.構建權利要求4所述的重組菌的方法，其特征在于，將亮氨酸脫氫酶基因SEQ?ID?NO.1連接到表達質粒載體pETDuet-1上，將含有亮氨酸脫氫酶基因的重組質粒pETDuet-1-ldh轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，得到重組菌E.coli?BL21-pETDuet-1-ldh。

6.權利要求4所述的重組菌在制備亮氨酸脫氫酶中的應用。

7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，在營養培養基中培養權利要求4所述的重組菌，收集具有亮氨酸脫氫酶活性的多肽。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，將重組菌E.coli?BL21-pETDuet-1-ldh，于5mL含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中振蕩培養37℃過夜；按1v/v％的接種量吸取培養液轉接到新的含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中進行培養，待OD_600nm達到0.6～1.0后，加入的IPTG至終濃度為0.1～1mM，于低溫下進行誘導表達，培養6～12h小時；離心收集菌液，倒掉上清培養基，用PBS等體積洗滌三次，加入Binding?Buffer使得重懸菌液OD_600nm達到20，加入終濃度為10～15v/v％的甘油，0.1～1mM的苯甲基磺酰氟，混勻；用超聲破碎儀破碎，破碎后，10000rpm離心30min取上清粗酶液；粗酶液用0.22μm膜過濾除去雜質，再采用親和介質填充層析柱鎳柱對重組蛋白進行純化。

9.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，制備得到的亮氨酸脫氫酶，在25℃，pH9.0條件下，純酶液的酶活為1289.39IU，比酶活為865.36U/mg；在50℃，pH9.0條件下，純酶液的酶活為1993.57IU，比酶活為1337.97U/mg。