[發明專利]一種核酸適配體親和有機-硅膠雜化毛細管整體柱的制備方法

無效

• 申請號: 201410305228.1
• 申請日: 2014-06-27
• 公開（公告）號: CN104248863A
• 公開（公告）日: 2014-12-31
• 發明（設計）人: 陳朗星;毛劼;何錫文;張玉奎
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: B01D15/22
• 分類號: B01D15/22;B01J20/281;B01J20/30
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

【技術領域】：本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種親和有機-硅膠雜化毛細管整體柱的制備，具體的說，是涉及一種對凝血酶具有特異性識別的親和毛細管整體柱的制備。

【背景技術】：整體柱(monolithic?column)具有獨特的結構和優異的特性，使其作為一種新型的色譜固定相受到了越來越多的關注。整體柱可分為有機聚合物整體柱、硅膠整體柱和有機-硅膠雜化整體柱。前兩者在具有一系列優點的同時也存在著不可避免的缺點，而有機-硅膠雜化整體柱(Organic-silicaHybridMonolithic?Column)結合了兩者的優點如制備簡單、易于改性、機械強度高、適用的pH范圍寬以及耐溶劑性能好，已經得到了越來越廣泛的應用。

親和色譜是利用修飾在色譜固定相上具有特異性識別功能的配體，與被分析物存在高效且專一的相互作用，從而實現樣品分離的過程。它具有較高選擇性，現在已廣泛應用于對復雜樣品的分離富集和定量分析中。樣品中待分析物的保留時間由待分析物與親和配體間的親和力大小決定。當它們間的親和力較弱時，可以不改變流動相就能將待分析物洗脫下來；而當它們間的親和力很強時，則需改變流動相的組成才得以將選擇性吸附的待分析物洗脫。核酸適配體親和色譜(Aptamer?Affinity?Chromatography)作為一種新型的色譜分離模式已經得到了研究者的關注，成功應用到分離小分子化合物、蛋白質和細胞中。Zhao等人將基于細胞色素C的核酸適配體通過非共價鍵結合在了有機聚合物整體柱基質上實現了對細胞色素C和凝血酶的分離與檢測(Zhao?Q，Li?X?F，Le?X?C.Aptamer?Modified?Monolithic?Capillary?Chromatography?for?Protein?Separation?and?DetectionAnal.Chem.2008，80：3915-3920)。

點擊化學是一類具有高選擇性的反應，其擁有一些獨特的優點，譬如起始反應物易得、產率高、反應條件溫和、對氧和水不敏感、且能得到單一的產物。已經發現的點擊化學反應如一價銅催化的疊氮和炔的反應、D-A環加成反應和一系列基于硫醇的點擊反應如硫醇-烯、硫醇-炔、硫醇-異氰酸鹽、硫醇-溴的反應。這些反應中，一價銅催化的疊氮和炔反應的應用最為廣泛，但因其重金屬催化劑的引入會污染反應基質且降低生物相容性，所以硫醇-烯加成反應(Thiol-ene?Chemistry)作為其替代受到了越來越多科研工作者的青睞。如Wang等人通過硫醇-烯的加成反應制備了C₁₈修飾的有機-硅膠雜化整體柱，成功分離了苯及芳香化合物(Wang?K?Y，Chen?Y?Z，Yang?H?H，et?al.Modification?of?VTMS?hybrid?monolith?via?thiol-ene?click?chemistry?for?capillary?electrochromatography.Talanta，2012，91：52-59)。Chen等人運用硫醇-烯的點擊反應制備了基于胰島素的酶反應器(Chen?Y?Z，Wu?M?H，Wang?K?Y，et?al.Vmyl?functionalized?silica?hybrid?monolith-based?trypsin?microreactor?for?on?line?digestion?and?separationviathiol-ene“click”strategy.JChromatogr?A，2011，1218：7982-7988)。這種快速合成化合物的新方法，已經成功應用到了新材料的合成和材料的后修飾過程中。目前，還沒有通過點擊化學的方式高效固定核酸適配體制備整體柱的相關報道。

【發明內容】：本發明的目的是拓展目前的核酸適配體的固定方法。傳統的固定方法是通過生物素與鏈霉親和素之間很強的特異性相互作用將核酸適配體通過非共價鍵的形式固定在整體柱基質上，而本方法應用點擊化學反應將核酸適配體通過共價鍵結合，實現了低成本、高效率、高穩定性的固定方法。得到的核酸適配體親和有機-硅膠雜化毛細管整體柱可實現對凝血酶的分離、富集和純化。

本發明提供的核酸適配體親和有機-硅膠雜化毛細管整體柱的制備方法，包括以下步驟：

第一、將四甲氧基硅烷和3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷尿素，聚乙二醇和乙酸混合，在0℃冰浴下攪拌4小時形成均一的預聚液；

第二、將上步形成的預聚液超聲脫氣，通氮氣除氧，注入已預處理的毛細管中，柱兩端用橡膠頭密封后放入45℃烘箱內熱引發聚合反應，沖洗除去致孔劑和未反應物；