[發明專利]用于蝴蝶蘭內參基因的TUA片段序列

無效

• 申請號: 201410303776.0
• 申請日: 2014-06-30
• 公開（公告）號: CN104017812A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 袁秀云;蔣素華;梁芳;王林青;王默霏
• 申請（專利權）人: 鄭州師范學院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 張曉萍

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體涉及用于蝴蝶蘭內參基因的TUA片段序列。

背景技術

蝴蝶蘭（Phalaenopsis?spp.）又名蝶蘭，花型優美，花色鮮艷，花序排列整齊，花期長達?3～5?個月，被譽為“洋蘭皇后”，具有很高的觀賞價值，也是很多地區年宵花的第一主打產品，在花卉產業中占據越來越重要的地位，隨著生物技術在花卉育種中的廣泛應用，蝴蝶蘭的發育調控分子機理成為研究的熱點，相關基因的表達分析是其分子調控機理研究的主要內容，實時定量PCR是基因定量表達分析研究的重要手段，實施實時定量PCR的關鍵是要有穩定表達的內參基因作為參考標準，內參基因的作用是使未知樣本總RNA量標準化，減少樣本之間的誤差，以獲得準確的數據（Suzuki等，2000，Biotechniques,2000,?29(2):332-7），目前常用的內參基因主要有18S?核糖體脫氧核糖核酸（18S?rRNA）,?甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）、肌動蛋白基因（ACTIN）和微管蛋白基因（TUA和TUB）等，但有研究表明,?這些常用的內參基因在不同的植物、不同的細胞類型或不同生理狀態下的表達并不是恒定不變的，在一定類型的細胞中或實驗因素條件下可能是變化的(Andersen?et?a1．，2004，Cancer?Research,?64：5245–5250；張艷君等，2007，生物化學與生物物理進展，34:546-550)。實時定量PCR技術的靈敏度高,要求內參基因更為穩定的表達，以滿足試驗的嚴謹性，保證數據的可靠性，盲目地選用內參基因，會因其自身表達的變化，導致實時定量PCR結果的準確性降低，甚至得到相反或錯誤的結論，在實時定量PCR中，選擇表達穩定的內參基因是技術的核心。在運用實時定量PCR進行蝴蝶蘭的基因定量分析研究中，僅有以肌動蛋白基因（ACTIN）作為內參基因的報道，在蝴蝶蘭不同發育階段及不同組織穩定表達的內參基因的研究更是空白。

發明內容

本發明的目的是獲得用于蝴蝶蘭內參基因的TUA片段序列，TUA片段序列見SEQ?NO.1。本發明通過多序列比對設計簡并引物，將利用簡并引物進行PCR擴增獲得的目的基因片段連接到T載體上進行測序，獲得α-微管蛋白基因（TUA）片段序列，根據TUA片段序列設計熒光定量特異引物，經實時熒光定量PCR檢測，確認TUA片段序列為可在蝴蝶蘭不同發育階段不同組織穩定表達的內參基因，其中簡并引物序列如下所示:

TUA-F:?AACTTYGCCCGYGGTCAYT；

TUA-R:?GGYTGGTAGTTGATRCCRCAC；

特異引物序列如下所示：

RT-TUAF:AAGCCATTTACGACATCTGCC；

RT-TUAR:GTGGTCAAGGATGAAATTATCTGAG。

為實現本發明目的，首先根據已知的植物微管蛋白基因設計簡并引物，以蝴蝶蘭幼苗期葉片為植物材料，進行PCR擴增及測序，然后對測序結果進行序列分析及實時定量表達穩定性檢測，得到在蝴蝶蘭不同發育階段及不同組織中穩定表達的TUA片段序列。其中，簡并引物如下所示：

TUA-F:?AACTTYGCCCGYGGTCAYT；

TUA-R:?GGYTGGTAGTTGATRCCRCAC；

TUA片段序列的分析是將序列及其編碼的氨基酸序列提交到蛋白數據庫中檢索確認；實時定量表達穩定性檢測是根據獲得的TUA片段序列設計實時熒光定量PCR的特異引物，特異引物序列如下：

RT-TUAF:AAGCCATTTACGACATCTGCC；

RT-TUAR:GTGGTCAAGGATGAAATTATCTGAG。

以蝴蝶蘭不同發育階段的根、葉片、莖、花葶、萼片、花瓣、唇瓣、子房、蕊柱等16種組織材料進行實時熒光定量PCR，依據溶解曲線及擴增產物的測序來確定引物的特異性，依據標準曲線獲得的擴增效率、相關系數確定數據的有效性，由實時熒光定量PCR的熒光閾值變化分析基因表達的穩定性，16種組織中的循環閾值平均值為20.57～24.21；以凝膠電泳的形式顯示TUA基因的表達情況，凝膠電泳條帶亮度一致，確定TUA片段序列表達具有穩定性；以此TUA片段序列作為內參基因檢測蝴蝶蘭的MADS-box基因DtpsMADS2的表達特性，結果表明，DtpsMADS2在營養器官和生殖器官均有表達，表達量以盛花期花葶中最高，在花器官各輪結構中只有少量表達，此測定結果與已有的研究報道結果一致。

本發明目的通過下列步驟實現：