[發(fā)明專利]慢生大豆根瘤菌和萊茵衣藻彼此促進(jìn)生長的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410303327.6
• 申請(qǐng)日: 2014-06-30
• 公開（公告）號(hào): CN104017763A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳雙秀;李德志;許麗麗;王全喜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院北京基因組研究所
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N1/12;C12R1/01;C12R1/89
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制氫技術(shù)，具體地說是利用慢生大豆根瘤菌和萊茵衣藻彼此促進(jìn)生長的方法。

背景技術(shù)

煤、石油、天然氣等化石燃料的大量使用造成了嚴(yán)重的環(huán)境問題；另一方面這些能源的儲(chǔ)量有限，長期無節(jié)制的使用造成了目前的能源短缺。氫氣是一種燃燒清潔、燃燒熱值高、利用形式多樣的可再生生物能源，是未來清潔能源體系的重要組成部分。微藻光合制氫技術(shù)是利用微藻和太陽能在特殊條件下生產(chǎn)氫氣的技術(shù)，被認(rèn)為是未來氫氣的可持續(xù)清潔生產(chǎn)的重要途徑。綠藻中的萊茵衣藻（Chlamydomonas?reinhardtii）氫化酶活性高，生長周期短，培養(yǎng)成本低，遺傳背景清晰，便于進(jìn)行分子操作，是國際上公認(rèn)的研究綠藻生物制氫的模式物種。

衣藻產(chǎn)氫量與其生物量密切正相關(guān)。目前對(duì)衣藻產(chǎn)氫的研究幾乎都是基于Melis提出的缺硫“兩步法”，而硫元素是植物生長的必需營養(yǎng)元素，缺硫會(huì)抑制衣藻生物量增加。有研究報(bào)道指出某些細(xì)菌可以促進(jìn)藻類的生長，例如鄭天凌等發(fā)現(xiàn)赤潮藻類塔馬亞歷山大藻與鹽敏芽孢桿菌共培養(yǎng)時(shí)，對(duì)雙方生物量積累均有一定的促進(jìn)作用；Ietswaart等發(fā)現(xiàn)缺陷假單胞菌和泡囊假單胞菌這兩種專性需氧菌與藻類共同培養(yǎng)可以促進(jìn)柵藻和小球藻的生長。因此，利用某些細(xì)菌與藻類共培養(yǎng)有可能促進(jìn)藻類的生物量累積。

日本慢生大豆根瘤菌（Bradyrhizobium?japonicum）屬于慢生型根瘤菌的一種，具有上述根瘤菌的一切生理特性。專利CN201210007835.0曾經(jīng)將慢生大豆根瘤菌與萊茵衣藻藻株cc849和轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻藻株lba混合共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)可以顯著提高衣藻的產(chǎn)氫量，并且能促進(jìn)藻株lba的生長。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種慢生大豆根瘤菌（Bradyrhizobium?japonicum）和萊茵衣藻（Chlamydomonas?reinhardtii）彼此促進(jìn)生長的方法，將慢生大豆根瘤菌和萊茵衣藻藻株在培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，使慢生大豆根瘤菌和萊茵衣藻的產(chǎn)量均有較大提高。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述萊茵衣藻藻株為cc124、cc503或轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻hemHc-lbac，優(yōu)選為轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻hemHc-lbac。

在本發(fā)明中，在共培養(yǎng)體系中，慢生大豆根瘤菌的濃度為OD₆₀₀＝1.0，萊茵衣藻的細(xì)胞濃度為OD₇₅₀=2.0，藻液與菌液的體積比為20～60∶1，優(yōu)選為25：1。所述培養(yǎng)基為正常培養(yǎng)基和缺硫培養(yǎng)基。

本發(fā)明將慢生大豆根瘤菌（以下簡(jiǎn)稱根瘤菌）與另外三種萊茵衣藻藻株cc124（以下簡(jiǎn)稱124）、藻株cc503（以下簡(jiǎn)稱503）和轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻hemHc-lbac（以下簡(jiǎn)稱hemHc-lbac）分別在正常培養(yǎng)基和缺硫培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，結(jié)果表明萊茵衣藻與根瘤菌的生長都受到促進(jìn)，并且在產(chǎn)氫衰減之前根瘤菌聚集在衣藻細(xì)胞周圍生長，說明萊茵衣藻與根瘤菌存在階段性互惠共生現(xiàn)象。本發(fā)明為進(jìn)一步拓寬根瘤菌的寄主范圍、促進(jìn)萊茵衣藻大規(guī)模培養(yǎng)的生物量累積、可再生生物能源生產(chǎn)、改善生態(tài)環(huán)境提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和新思路。

具體實(shí)施方式

下面將進(jìn)一步的詳細(xì)舉例說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對(duì)本發(fā)明要求保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說明，并非對(duì)這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所附權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。

萊茵衣藻（C.?reinhardtii）藻株cc124、cc503購自美國萊茵衣藻中心（Chlamydomonas?Resource?Center，http://chlamycollection.org/），轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻藻株hemHc-lbac由本實(shí)驗(yàn)室許麗麗構(gòu)建（構(gòu)建方法參見上海師范大學(xué)碩士論文：密碼子優(yōu)化對(duì)豆血紅蛋白基因在萊茵衣藻葉綠體中表達(dá)和產(chǎn)氫的影響，作者許麗麗，2011年）。缺硫培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱TAP-S）是把正常培養(yǎng)基內(nèi)的硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸銅和硫酸鋅分別換為等摩爾的氯化鎂、氯化鐵、氯化銅和氯化鋅。日本慢生大豆根瘤菌（B.?japonicum）購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

實(shí)施例1正常培養(yǎng)基中共培養(yǎng)