[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)pH值的熒光探針及其制備方法與專用檢測(cè)試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410301495.1
• 申請(qǐng)日: 2014-06-27
• 公開（公告）號(hào): CN104086536A
• 公開（公告）日: 2014-10-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬會(huì)民;萬瓊瓊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院化學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C07D405/06
• 分類號(hào): C07D405/06;C09K11/06;C09B23/10;G01N21/64
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;王春霞

1.式Ⅰ所示化合物，

式Ⅰ中，X為碳原子數(shù)為1～6的烷基、磺酸基取代的碳原子數(shù)為1～6的烷基、磺酸鈉基取代的碳原子數(shù)為1～6的烷基和磺酸鉀基取代的碳原子數(shù)為1～6的烷基中的任一種；

Y的結(jié)構(gòu)式如式Ⅱ所示：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于：其結(jié)構(gòu)式如式Ⅲ，

3.權(quán)利要求1或2所述化合物的制備方法，包括如下步驟：

(1)式Ⅳ所示二羥基苯甲醛和嗎啉經(jīng)還原反應(yīng)，得到式Ⅴ所示取代嗎啉甲基苯基二醇；

(2)惰性氣氛下，在堿存在的條件下，式Ⅴ所示取代嗎啉甲基苯基二醇與式Ⅵ所示三碳菁類染料經(jīng)取代分解重排反應(yīng)，即得式Ⅰ所示化合物；

式Ⅵ

式Ⅵ中，X為碳原子數(shù)為1～6的烷基、磺酸基取代的碳原子數(shù)為1～6的烷基、磺酸鈉基取代的碳原子數(shù)為1～6的烷基和磺酸鉀基取代的碳原子數(shù)為1～6的烷基中的任一種；

式Ⅰ中，X為碳原子數(shù)為1～6的烷基、磺酸基取代的碳原子數(shù)為1～6的烷基、磺酸鈉基取代的碳原子數(shù)為1～6的烷基和磺酸鉀基取代的碳原子數(shù)為1～6的烷基中的任一種；

Y的結(jié)構(gòu)式如式Ⅱ所示：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟(1)中，式Ⅳ所示二羥基苯甲醛和所述嗎啉的摩爾比為1～5：1；

所述還原反應(yīng)在還原劑作用下進(jìn)行；所述還原劑與式Ⅳ所示二羥基苯甲醛的摩爾比為1～5：1；

所述還原劑為H₂、LiAlH₄和NaBH₄中任一種；

所述還原反應(yīng)的反應(yīng)溫度可為0～50℃；反應(yīng)時(shí)間可為10～200min；

所述還原反應(yīng)在有機(jī)溶劑中進(jìn)行；所述有機(jī)溶劑為甲醇。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于：步驟(2)中，所述堿與式Ⅴ所示取代嗎啉甲基苯基二醇的摩爾比為0.01～1：1；

所述堿為有機(jī)堿和無機(jī)堿中的至少一種；

所述有機(jī)堿為三乙胺和吡啶中至少一種；所述無機(jī)堿為碳酸鉀、氫氧化鈉、碳酸鈉和碳酸氫鈉中至少一種；

式Ⅵ所示三碳菁類染料與式Ⅴ所示取代嗎啉甲基苯基二醇的摩爾比為1：0.1～1；

所述取代分解重排反應(yīng)的反應(yīng)溫度為40～100℃，；反應(yīng)時(shí)間為1～10h；

所述取代分解重排反應(yīng)在有機(jī)溶劑中進(jìn)行；所述有機(jī)溶劑為四氫呋喃、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜中至少一種。

6.一種檢測(cè)pH值的試劑盒，包括式Ⅰ所示化合物和溶劑；

式Ⅰ所示化合物的濃度為0.01mM～100mM；

所述溶劑為水、乙醇和二甲基亞砜中任一種。

7.式Ⅰ所示化合物或權(quán)利要求6所述試劑盒在檢測(cè)水溶液pH值、檢測(cè)溶酶體pH值或標(biāo)記溶酶體中的應(yīng)用。

8.一種溶酶體pH值的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

(1)向載有式Ⅰ所示化合物的樣品中分別加入至少3種不同pH值且均含有尼日利亞菌素鈉的磷酸鹽緩沖溶液；

所述pH值為4～6；

所述式Ⅰ所示化合物的濃度為1nM～1μM；

所述樣品為離體細(xì)胞；

(2)使用激光共聚焦顯微鏡或酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光測(cè)試；

使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光測(cè)試時(shí)，激發(fā)波長為635nm，選擇收集通道為大于650nm小于750nm的任意兩個(gè)波段，分別測(cè)定不同pH值的所述樣品的熒光強(qiáng)度；

使用酶標(biāo)儀測(cè)試時(shí)，激發(fā)波長為635nm，分別測(cè)定不同pH值的所述樣品在波長為670nm和708nm處的熒光強(qiáng)度；

(3)使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光測(cè)試時(shí)，計(jì)算兩個(gè)收集波段的熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值，以收集波段的熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值為縱坐標(biāo)，以pH值為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；

使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)試時(shí)，計(jì)算波長為670nm和708nm的熒光強(qiáng)度的比值I₆₇₀/I₇₀₈或I₆₇₀/I₇₀₈，以I₆₇₀/I₇₀₈或I₆₇₀/I₇₀₈為縱坐標(biāo)，以pH值為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(4)在與步驟(2)中相同的條件下，測(cè)量載有式Ⅰ所示化合物的溶酶體樣品與步驟(2)所述波段相同的熒光發(fā)射強(qiáng)度比值，根據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線即得出所述溶酶體樣品的pH值。