[發明專利]一種利用小孢擬盤多毛孢液態發酵生產pestalotiollide A的方法

無效

• 申請號: 201410301403.X
• 申請日: 2014-06-27
• 公開（公告）號: CN104017840A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 朱旭東;牛學良;于溪
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12P17/08
• 分類號: C12P17/08;C12R1/645
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

1.一種利用小孢擬盤多毛孢液態發酵生產pestalotiollide?A的方法，其特征在于，該方法首次采用PDB改良型培養基PLB對小孢擬盤多毛孢（Pestalotiopsis?microspora）進行液態發酵生產pestalotiollide?A，并對其進行后續分離純化工序，具體包括如下步驟：

第1步、首先將絲狀真菌小孢擬盤多毛孢Pestalotiopsis?microspora從甘油管中活化至PLA平板上，控制溫度為24-29℃，培養48-96h，直至長出新鮮菌絲；

第2步、將經平板培養的Pestalotiopsis?microspora菌絲尖端切塊接種到液體培養基PLB中，溫度為24-29℃、轉速160-190rpm、培養72-240h，收集孢子；

第3步、將經孢子培養獲得的孢子懸浮液接種到發酵培養基PLB中，控制發酵培養的溫度為24-29℃、轉速160-190rpm、培養120-288h；

第4步、培養結束的發酵產物經2層濾紙減壓過濾，固液分離得到Pestalotiopsis?microspora發酵濾液；

第5步、將第4步所得濾液使用大孔樹脂或活性炭脫色；

第6步、將第5步所得脫色液用有機溶劑萃取，收集有機相，減壓加熱蒸發至干,?甲醇溶解殘留物，得到pestalotiollide?A粗提物；

第7步、將第6步所得粗提產物用半制備型HPLC進行純化，得到pestalotiollide?A精提物。

2.?根據權利要求1所述的方法，其特征在于第1步中的平板培養基為PDA改良培養基，即PLA培養基，其組成為：去皮馬鈴薯180-220g/L，乳糖15-25g/L，瓊脂粉20g/L。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于第2步中所述液體培養基為PDB改良培養基，即PLB培養基，其組成為：去皮馬鈴薯180-220g/L，乳糖15-25g/L。

4.?根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述菌株在任意體積三角瓶或其他培養設備中進行深層液體培養。

5.?根據權利要求1至4任一項所述的方法，其特征在于，在第5步所述的大孔樹脂為NKA-9、AB-8或D3520大孔樹脂，所述的活性炭為顆粒性活性炭或粉末性活性炭；其中粉末性活性炭用量為每升發酵液加入活性炭5-20g，脫色條件為：溫度40-70℃，時間20-50min，pH?6.0-8.0。

6.?根據權利要求1至4任一項所述的方法，其特征在于，在第6步所述的萃取過程中，有機溶劑選用1-2倍體積乙酸乙酯,?常溫萃取3-12h，重復1-3次。

7.根據權利要求1至4任一項所述的方法，其特征在于，在第7步所述半制備型HPLC層析柱選用的填料為C₁₈，流動相為甲醇和水的混合物。