[發明專利]一種血液單核細胞分離的輔助部件

在審

• 申請號: 201410300855.6
• 申請日: 2014-06-24
• 公開（公告）號: CN104293644A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 易銀沙;張萬明;朱海強;鄒義洲;許澎;劉彩云;袁炳秋;吳小寧
• 申請（專利權）人: 長沙贏潤生物技術有限公司
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及細胞分離領域，具體是一種血液單核細胞分離的輔助部件。

背景技術

單核細胞(英語：Monocyte)是人體免疫系統中的一種白細胞。單核細胞來源于骨髓中的造血干細胞，并在骨髓中發育。當它們從骨髓進入血液時仍然是尚未成熟的細單核細胞胞。與其他血細胞比較，單核細胞內含有更多的非特異性脂酶，并且具有更強的吞噬作用。單核細胞在血液中停留2-3天后遷移到周圍組織中，細胞體積繼續增大，直徑可達50-80μm，細胞內所含的溶酶體顆粒和線粒體的數目也增多，成為成熟的細胞。固定在組織中的單核細胞稱為組織巨噬細胞，它們經常大量存在于淋巴結、肺泡壁、骨髓、肝和脾等器官。激活了的單核細胞和組織巨噬細胞能生成并釋放多種細胞毒、干擾素和白細胞介素，參與機體防衛機制，還產生一些能促進內皮細胞和平滑肌細胞生長的因子。在炎癥周圍單核細胞能進行細胞分裂，并包圍異物。單核細胞(monocytes)是體積最大的白細胞。其細胞核常偏位，呈多形性，如卵圓形、腎形、馬蹄形、不規則形等，常有折疊感；染色質呈疏松網狀，著色較淺。胞質較多，嗜堿性，但因含大量細小的嗜天青顆粒而染成灰藍色，顆粒含過氧化物酶。

在醫學和生物學上，單核細胞是免疫細胞和血液干細胞的來源，為此，分離技術得到快速發展，現有最常用的單核細胞分離技術就是密度梯度區帶離心法(簡稱區帶離心法)。

密度梯度離心法是將樣品加在惰性梯度介質中進行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區帶的分離方法。此法的優點是：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；②適應范圍廣，能象差速離心法一樣分離具有沉降系數差的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒；③顆粒不會擠壓變形，能保持顆?；钚?，并防止已形成的區帶由于對流而引起混合。此法的缺點是：①離心時間較長；②需要制備惰性梯度介質溶液；③操作嚴格，不易掌握。

密度梯度離心法亦稱平衡密度梯度離心法。用超離心機對小分子物質溶液，長時間加一個離心力場達到沉降平衡，在沉降池內從液面到底部出現一定的密度梯度。若在該溶液里加入少量大分子溶液，則溶液內比溶劑密度大的部分就產生大分子沉降，比溶劑密度小的部分就會上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子帶狀物。利用這種現象，測定核酸或蛋白質等的浮游密度，或根據其差別進行分析的一種沉降平衡法。自1958年米西爾遜(M.Meselson)，斯塔爾(F.W.Stahl)，維諾格拉德(J.Vinograd)成功地分離了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA以來，該法取得許多成果。為得到必要的濃度梯度，多采用濃氯化銫溶液，所以有時也使用氯化銫濃度梯度離心法這個名稱，還可采用氯化銣、溴化銫等溶液。通常利用分析超離心機，但在將細胞顆粒成分進行分離等以純化為目的的情況，利用密度差，使用分離超離心機，采用預先制備好的蔗糖等的密度梯度?！?〕采用蔗糖等一些小分子溶液，預先在分離超離心機的樣品地內制備出密度梯度，在其上面再加上一層少量的大分子溶液后，離心，大分子就形成層狀而沉降。若含有沉降系數不同的許多成分，就會出現許多層。這種情況采用適當的編排號碼，取出樣品池內的溶液，然后進行研究。這是與〔1〕不同的一種沉降速度法，除了以相同的目的被用于通常的沉降速度法外，在能取出分離物這點上是有優越性的。因多采用蔗糖密度梯度，所以亦稱為蔗糖密度梯度離心法。

原理：不同顆粒之間存在沉降系數差時，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區域上形成區帶的方法。介質梯度應預先形成，介質的最大密度要小于所有樣品顆粒的密度。常用的有蔗糖、甘油；密度梯度液的制備用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。

步驟

1.在離心管中加入適量淋巴細胞分離液。

2.取肝素抗凝靜脈血與等量生理鹽水充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000rpm×20分鐘。

3.離心后管內分為三層，上層為血漿和生理鹽水的混合液，下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，這一層就是單個核細胞，包括淋巴細胞和單核細胞。此外，還含有血小板。

4.用毛細血管插到云霧層，吸取單個核細胞。置入另一短中管中，加入5倍以上體積的生理鹽水，1500rpm×10分鐘，洗滌細胞兩次。

5.末次離心后，棄上清，加入含有10％胎牛血清的RPMI1640，重懸細胞。取一滴細胞懸液與一滴0.2％臺盼蘭染液混合，于血球計數板上，計數四個大方格內的細胞總數。