[發明專利]一種左聚糖蔗糖酶融合蛋白及其編碼基因與應用

有效

• 申請號: 201410300091.0
• 申請日: 2014-06-27
• 公開（公告）號: CN104017785A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 楊輝;黃日波
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/62;C12N15/63;C12N5/10;C12P19/04
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司 11279
• 代理人: 王正茂

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及一種左聚糖蔗糖酶融合蛋白及其編碼基因與應用。

背景技術

左聚糖(Levan)是指以β-(2，6)糖苷鍵連接而成的高分子量果聚糖，分子量可高達200萬以上，主要來源于微生物。研究表明，高分子量左聚糖具有抗病毒，抗腫瘤，增強免疫等多種生物功能，可廣泛應用于低熱減脂食品、減肥產品、益生元、膳食纖維、乳化劑、凝膠劑、保濕劑等領域。有研究表明左聚糖具有和透明質酸相當的保濕性能和生物相容性，因此在化妝品行業的應用前景非常廣闊，目前韓國進口產品在該領域國內市場占據壟斷地位。

左聚糖蔗糖酶(levansucrase)也被稱為果糖基轉移酶(EC2.4.1.10，FTase,Lls,FTF,fructosyltransferase,sucrose:2,6-D-fructan-6-D-fruct?osyltransferase)，是一類可以通過轉糖苷反應，將蔗糖中的果糖聚合形成大分子量果聚糖即左聚糖的酶。

作為我國蔗糖大省，廣西的蔗糖產量已經占全國產量的60％以上，然而廣西的制糖產業一直存在產品單一、缺乏深加工和高附加值產品開發。開發高效左聚糖蔗糖酶，以蔗糖為底物生產高附加值的左聚糖產品，可以大幅提升廣西制糖業的經濟價值，擴增產品線，促進農民增收，具有很好的應用前景和社會效益。

國內關于利用微生物發酵方式產生左聚糖的研究報道較少，遠未能成熟地實現產業應用。利用分子改造的左聚糖蔗糖酶轉化蔗糖生產左聚糖的研究開展得更少。目前國內外已經報道的左聚糖蔗糖酶其最適反應溫度大多為4-16℃，普遍存在著反應熱穩定性不佳、最適反應溫度低、高溫下轉化率降低等問題，嚴重制約了生產應用。

為了實現左聚糖生產的國產化和自主化，沖破進口產品的市場壟斷，本專利研究利用現代微生物生物技術、蛋白質工程、分子酶工程等先進手段，通過融合蛋白的方式改造合成新的左聚糖蔗糖酶融合基因，并在原核或真核微生物中表達出最適反應溫度顯著提高的左聚糖蔗糖酶重組蛋白，為今后工業化大規模生產新型耐高溫左聚糖蔗糖酶奠定良好基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種左聚糖蔗糖酶融合蛋白及其編碼基因，以及該蛋白及其編碼基因在制備左聚糖生產中的應用。

為實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：

本發明所提供的左聚糖蔗糖酶融合蛋白，名稱為STHB6，是具有序列表中SEQ?ID?NO:1氨基酸序列的蛋白質，或者是將SEQ?ID?NO:1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代且具有與SEQ?ID?NO:1的氨基酸序列相同活性的由SEQ?ID?NO:1衍生的蛋白質。

序列表中序列1的氨基酸序列是由897個氨基酸殘基組成的蛋白質。

一種編碼SEQ?ID?NO:1所示蛋白的基因，名稱為sthb6，所述基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

序列2的DNA序列由2694個堿基組成。

含有核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示基因的表達載體及細胞系均屬于本發明的保護范圍。

上述所述蛋白、基因以及含有該基因的表達載體、細胞系在左聚糖制備及其他轉糖苷反應、糖水解反應過程中的應用。

所述左聚糖蔗糖酶融合蛋白的制備方法，包括下列步驟：將融合蛋白編碼基因與表達載體連接后導入基因工程菌進行融合蛋白的表達，將所得的融合蛋白進行純化即可獲得左聚糖蔗糖酶融合蛋白。

本發明的突出的實質性特點和技術效果在于：

本發明利用現代微生物生物技術、蛋白質工程、分子酶工程等先進手段，將來自嗜熱棲熱菌Thermus?thermophilus?TtHB-8的海藻糖合成酶C末端(該末端與海藻糖合成酶熱穩定性相關)結構域的基因片段融合到枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)編碼左聚糖蔗糖酶的基因中，獲得一個新的左聚糖蔗糖酶編碼基因sthb6，并在原核或真核微生物中表達，獲得融合蛋白。