[發明專利]用于鑒定云豹的多重PCR引物和方法以及它們在鑒定云豹中的應用

有效

• 申請號: 201410299744.8
• 申請日: 2014-06-27
• 公開（公告）號: CN104059978A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發明（設計）人: 晏鵬;晏龍;耿章珍;吳孝兵
• 申請（專利權）人: 安徽師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京潤平知識產權代理有限公司 11283
• 代理人: 孫向民;董彬

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，具體地，涉及一種用于鑒定云豹的多重PCR引物及使用所述多重PCR引物鑒定云豹的方法，以及它們在鑒定云豹中的應用。

背景技術

基于分類學的準確物種鑒定是人類認知自然和可持續發展的必要前提。它為生物多樣性的保護、物種資源的可持續性利用，以及生物來源的新產品開發等提供了知識和理論基礎。對于物種的鑒定，傳統的方法主要是采用形態學證據來進行。但該方法的一些缺陷也造成了瀕危動物保護工作的局限，例如表型可塑性和遺傳可變性、無法區分隱存分類單元、受生物性別和發育階段限制等。在野生動物保護的實踐工作中，一些來源不明的送檢動物樣品往往是不完整且樣品量較小，已很難從形態學上加以識別，如毛發、殘肢、腐敗組織、骨骼、皮張及糞便等。但是，根據《中華人民共和國野生動物保護法》的規定，準確的物種信息是量刑的重要法律證據，直接涉及到犯罪嫌疑人的切身權力和行政部門的嚴格執法問題。

云豹(Neofelis nebulosa)是哺乳綱(Mammalia)食肉目(Carnivora)貓科(Felidae)云豹屬(Neofelis)的貓科動物。云豹身體兩側具云狀的暗色斑紋，體長約70～110厘米，尾長約70～90厘米，體重約16～40千克，為豹亞科最小者。云豹在中國的分布北限在陜西秦嶺、甘肅南部，西至西藏察隅等地，南止于海南省，東至浙江省及臺灣省。我國共有兩個亞種：指名亞種(Neofelis nebulosa nebulosa)，我國云豹皆為指名亞種；臺灣亞種(Neofelisnebulosa brachyurus)，現已滅絕。云豹作為食物網中的頂級食肉動物，捕食多種動物，在營養級序列中占據著多個級別，也是維持生態系統功能和生物多樣性水平的關鍵物種。與世界其它的貓科動物一樣，云豹同樣受到分布密度低、活動范圍大、獵物數量下降、偷獵等因素的廣泛威脅。在中國，云豹已被列為國家一級重點保護野生動物。在全世界，也被列入世界自然保護聯盟(IUCN)易危(VU)級物種，同時還被《瀕危野生動植物種國際貿易公約》(CITES)列入附錄I物種，云豹及其物種產品被嚴格禁止國際商業貿易。因此，在實際的野生動物保護工作中，對云豹物種及其相關制品進行科學、準確地物種鑒定是開展各項執法工作的前提。

另一方面，由于受到活動隱匿、難以捕獲等原因的限制，目前開展有關大型貓科動物的種群生態學研究只能依賴于間接的證據，例如痕跡證據(如足跡、擦痕、尿跡及抓痕等)和對當地居民的走訪調查等。但痕跡僅能對野生云豹種群提供定性的數據，并不能實現跟蹤并監測野外種群的數量動態波動。近年來，以動物糞便為研究材料的糞便DNA分析技術極大地擴展了非損傷性取樣的范圍，豐富了保護遺傳學的研究技術。通過對糞便DNA中多種遺傳標記的識別，研究者可以對野生動物的種群數量調查、領域邊界劃定、生活史、種群遺傳結構和遺傳多樣性等方面進行深入的研究。在開展基于糞便DNA的獸類種群生態學研究中，往往需要研究者首先對采自野外的大量獸類糞便樣品根據糞型特點進行初步的判別，將云豹物種的糞便單獨挑選出來備用，這是一項非常耗費時間的前期準備工作。同時，由于糞型等形態學特征往往在野外及送回實驗室的運輸過程中容易受到破壞，給大量糞便樣品的識別和鑒定帶來困難。如果依靠分子測序方法進行鑒定，則會造成花費增大的經濟問題。此外，已有大量研究表明，較小擴增產物長度(一般<500bp)可有效地提高針對糞便DNA的PCR特異性和成功率。這要求我們開發的特異引物擴增產物還必須具有片度不能太大的特點。

近年來DNA分類鑒定技術的飛速發展為物種的保護、野生動物的有效管理提供了強大的工具。動物線粒體DNA(mtDNA)的Cyt b基因和12SrRNA基因中同時存在較快和較慢進化的密碼子位點，以及保守區域和突變區域的存在使得其可應用于動物系統學研究。目前被廣大學者認為是開展動物種上和種下階元間系統進化研究最好的分子遺傳標記之一。

因此，提供一種無需DNA的測序、序列比對等繁瑣步驟，同時對樣品來源無限制，且可僅通過一次PCR擴增即可快速有效地實現對云豹物種的精確測定的多重PCR引物是本發明亟需解決的問題。

發明內容

針對上述現有技術，本發明的目的在于克服現有技術中通過形態學特征對云豹物種進行測定的局限性，或是以常規方法對糞便中DNA進行測定來確定物種的方法的耗時耗力且花費較大的問題，提供一種簡便快捷且經濟的用于鑒定云豹的多重PCR引物和鑒定云豹的方法，以及它們在鑒定云豹中的應用。