[發明專利]一種植物基因啟動子克隆方法

無效

• 申請號: 201410295718.8
• 申請日: 2014-06-26
• 公開（公告）號: CN104017803A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 李廣平;曹福亮
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/113
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 胡錫瑜

一、技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種植物基因啟動子克隆方法。

二、背景技術

啟動子是一段位于基因上游供RNA聚合酶識別和結合的DNA序列，是基因表達調控的重要區段，其長度因生物種類而異，一般500-1000bp。啟動子克隆對于構建基因工程載體，表達目的蛋白有著重要的意義。

近年來報道了多種植物啟動子克隆的方法，大都是基于PCR技術進行的，如錨定PCR法、反向PCR法、交錯熱不對稱PCR等。錨定PCR是擴增已知序列側翼未知片段的方法。此方法高效快捷、高產率、高度特異敏感，但需要知道啟動子相鄰序列，且要構建基因組文庫。反向PCR是一種改進的染色體步行方法。該方法快速、高效、穩定，操作相對簡單，花費少，引物設計比較方便，但如果限制性內切酶的選取不好，啟動子就不能被克隆出來。熱不對稱交錯PCR是一種用來分離與已知序列鄰近的未知DNA序列的分子生物學技術。該法特異性高，快速，不涉及連接反應，但需要較多的引物組合，反應條件的設置要求比較精細。

三、發明內容

本發明需要解決的問題是提供一種簡單、高效的植物基因啟動子克隆方法。

本發明所提供的啟動子克隆方法，主要包括引物的設計、接頭的制備、基因組DNA的限制性酶切、接頭的連接、巢式PCR擴增、電泳檢測等步驟。

1.引物的設計

(1)基因內部引物設計

根據目的基因DNA5’端序列反向設計一對嵌套PCR引物：GSP和NGSP。

(2)接頭引物設計

根據接頭序列之一設計一對巢式接頭引物AP1和AP2。

2.接頭的制備

將接頭序列5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3’與5’-PO₄-ACCAGCCC-NH₂-3’分別配置成50μM的溶液，然后在10×PCR?buffer(With?Mg²⁺)中經變性、退火、冷卻，最后貯存于-20備用。

3.基因組DNA的限制性酶切

選擇一種在目的基因內部沒有切點的限制性內切酶將基因組切成彌散狀(凝膠電泳檢測)。

4.接頭的連接

使用T4DNA連接酶將基因組限制性酶切產物與制備好的接頭進行連接，-20℃貯存備用。

5.巢式PCR擴增

使用一對從基因內部設計的嵌套引物和一對巢式接頭引物對連有接頭的基因組酶切產物進行兩輪PCR擴增。

6.電泳檢測

對PCR擴增產物采用瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

7.產物測序

將經瓊脂糖凝膠電泳分離的PCR產物純化回收后交給公司測序

本發明所述一種植物基因啟動子克隆方法，由以下步驟構成：

(1)使用一種在目的基因內部沒有切點的限制性內切酶降解植物基因組DNA；

(2)設計兩條接頭序列，分別為5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3’與5’-PO₄-ACCAGCCC-NH₂-3’，將兩條序列退火制備成接頭；

(3)將接頭與酶解后的基因組片段進行連接，制備成兩段帶有接頭的DNA片段；

(4)從靠近目的基因5’端的地方反向設計一條引物，同時根據長接頭序列進行另一條引物設計；

(5)使用一種熱啟動DNA聚合酶進行PCR擴增，擴增反應采用兩步法，PCR反應條件采用溫度梯度退火反應法。第一步反應程序為：94℃5分鐘；94℃2秒，72℃3分鐘，2個循環；94℃2秒，70℃3分鐘，2個循環；94℃2秒，68℃3分鐘，2個循環；94℃2秒，66℃3分鐘，32個循環；66℃10分鐘；第二步反應程序為：94℃5分鐘；94℃2秒，72℃3分鐘，2個循環；94℃2秒，70℃3分鐘，2個循環；94℃2秒，68℃3分鐘，2個循環；94℃2秒，66℃3分鐘，20個循環；66℃10分鐘；

(6)取10μL反應產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，使用DNA分子量標準作為對照，將凝膠在紫外燈下觀察、拍照，根據特異性條帶的分子量大小判斷所克隆的啟動子片段的長度。

本發明與現有技術相比其有益效果是本發明提供了一種簡單、高效的植物啟動子克隆方法，該方法操作簡單快速，而且成本低，并可以非常有效地克隆到1000bp以上的啟動子序列。本發明方法適用于所有植物。