[發明專利]一種高靈敏度的多菌靈完全抗原的合成方法有效

申請號：	201410291378.1	申請日：	2014-06-26
公開（公告）號：	CN104017070A	公開（公告）日：	2014-09-03
發明（設計）人：	徐麗廣;胥傳來;嚴會娟;匡華;馬偉;劉麗強;宋珊珊;吳曉玲	申請（專利權）人：	江南大學
主分類號：	C07K14/765	分類號：	C07K14/765;C07K14/795;C07K14/77;C07K1/107;C07K16/44;G01N33/53
代理公司：	無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104	代理人：	時旭丹;劉品超
地址：	214122 江蘇省無錫市***	國省代碼：	江蘇;32
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種靈敏度多菌靈完全抗原合成方法
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及一種高靈敏度的多菌靈完全抗原的合成方法，屬于生物化工技術領域。

背景技術

多菌靈是一種廣譜、高效、低毒內吸性苯并咪唑類殺菌劑。其化學結構式如下：

其作用機理是，通過干擾細胞紡錘體的形成從而干擾細胞分裂，對植物具有良好的保護和治療作用。廣泛應用于各類農產品中，對多種作物由真菌（如半知菌、多子囊菌）引起的病害有防治效果。可用于葉面噴霧、種子處理和土壤處理等。多菌靈對動物肝、腎和生殖系統具有潛在的破壞作用。

目前檢測多菌靈的方法主要是氣相色譜法(GC)，液相色譜法(HPLC)，分光光度法、導數同步熒光法、薄層層析-分光光度法、氣質聯用法等紫外儀器方法，但是這些方法存在操作繁瑣，耗時，費用比較貴等缺點，不能實現大量樣品的快速檢測，因此建立一種快速簡便的多菌靈檢測方法具有重要意義。

酶聯免疫法（ELISA）是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，檢測時對樣本的純度要求不高而且操作簡便，適用于大量樣本的現場快速檢測。然而得到高親和力和高特異性的單克隆抗體是免疫學檢測的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。

由于多菌靈是小分子物質（分子量?Mw<1000Dal），本身不具有誘導機體產生抗體的能力，需要和蛋白載體偶聯后，才能具有免疫原性。但是多菌靈結構中沒有可以直接利用的活性基團如-COOH、-NH2?、-OH?或-SH?等，因此，要實現多菌靈和載體蛋白的偶聯，首先要進行多菌靈半抗原的設計和合成。

根據相關報道，為了保證半抗原和大分子載體蛋白偶聯后能夠最大限度的被識別，需要在目標分子和載體之間有一定的連接臂；同時要求連接臂應盡量遠離半抗原分子的特征性基團，目的是突出半抗原的特征性結構，突出其抗原決定簇。一般選擇4-6個碳鏈長度的手臂。根據上述原則，本發明設計了多菌靈半抗原及完全抗原的合成方法，為建立多菌靈的酶聯免疫分析方法提供了有利條件。

影響免疫分析方法的關鍵因素在于特異性的抗原和抗體。本發明中合成了由多菌靈的類似物2-氯苯并咪唑和6-氨基己酸反應得到具有羧基的半抗原H1，半抗原H1與載體蛋白偶聯制備免疫原；基于異源包被可以進一步提高抗體的靈敏度，另一種半抗原H2由多菌靈的類似物氨基氯苯并咪唑和6-氨基己酸反應得到，H2與OVA偶聯得到包被原，這兩種半抗原目前尚無文獻報道。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足之處，提供一種多菌靈半抗原H1及其完全抗原的制備方法。

本發明的技術方案，

半抗原H1的合成路線如下所示：

一種多菌靈完全抗原的制備方法，步驟如下：

（1）前體261的合成：將氨基己酸甲酯鹽酸鹽與等摩爾量的2-氯苯并咪唑混合，于二異丙基乙基胺中微波150℃過夜反應13h，得到產物，經純化，即得到前體261，產率為10%；

（2）多菌靈半抗原H1的合成：將步驟（1）制備的前體261溶于四氫呋喃中，室溫攪拌反應過夜，60℃旋蒸除去四氫呋喃，以1mol/L的HCl溶液調節pH?至6~7，制備色譜純化得多菌靈半抗原H1；

（3）多菌靈完全抗原的制備：將多菌靈半抗原H1與載體蛋白上的氨基進行偶聯，即得到多菌靈完全抗原。

步驟（1）所述的氨基己酸甲酯鹽酸鹽由氨基己酸和氯化亞砜在甲醇中回流制得。

步驟（2）所述多菌靈半抗原H1，其結構簡式如下所示：

????????????H1?????????????。

步驟（3）所述載體蛋白為牛血清白蛋白BSA、匙孔血藍蛋白KLH、血藍蛋白LPH、雞卵清白蛋白OVA或人血清白蛋白HAS中的一種。