[發明專利]一種分離鑒定糖蛋白N-糖鏈結構的方法

有效

• 申請號: 201410291021.3
• 申請日: 2014-06-24
• 公開（公告）號: CN104133027A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 關鋒;楊剛龍;譚增琦;李想;郭佳;龐星辰
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N30/72
• 分類號: G01N30/72;G01N30/08
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

1.一種分離鑒定糖蛋白N-糖鏈結構的方法，其特征在于，向變性蛋白中加入刀豆凝集素，使之與高甘露糖型N-糖基化蛋白相結合，然后加入糖肽酶F釋放全N-糖鏈，離心收集與ConA結合的非高甘露糖型N-糖鏈；再利用競爭性抑制將高甘露糖型N-糖鏈從ConA上競爭性洗脫下來并收集；最后，對收集的糖鏈進行除鹽純化處理、MALDI-TOF/TOF質譜解析。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，將樣品蛋白質加入到超濾管中，用二硫蘇糖醇及碘乙酰胺使之變性。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述競爭性抑制劑是α-甲基-甘露糖。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)非高甘露糖型N-糖鏈的分離、富集：將蛋白加入超濾管中，采用尿素初步變性，然后通過二硫蘇糖醇及碘乙酰胺進一步使蛋白變性，向變性蛋白中加入ConA，使之與高甘露糖型N-糖基化蛋白相結合，然后加入糖肽酶F釋放全部的N-糖鏈，離心收集未與ConA結合的非高甘露糖型N-糖鏈；(2)高甘露糖型N-糖鏈的分離、富集：向仍與ConA結合并留在超濾管濾膜上的高甘露糖型N-糖鏈中添加α-甲基-甘露糖，將高甘露糖型N-糖鏈從ConA上競爭性替換下來，通過離心收集高甘露糖型N-糖鏈；(3)糖鏈的除鹽純化：利用Sepharose?4B對糖鏈進行純化；(4)MALDI-TOF/TOF質譜解析。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，非高甘露糖型N-糖鏈的分離、富集采用如下具體步驟：

取1-2mg蛋白加入超濾管中，14000g離心濃縮至50μL，直接加300μL的8M尿素，充分混勻，14000g離心15min；再加入200μL8M尿素溶液至超濾管，14000g離心15min，棄去收集管中的流出液；

加入150μL的10mM?DTT充分混勻，56℃孵育45min，14000g離心10min，加入150μL20mM的IAM充分混勻，暗處孵育20min，14000g離心10min，棄去收集管中的流出液；加入150μL偶聯緩沖液至超濾管中，14000g離心10min，重復加入偶聯緩沖液并離心3次，棄去收集管中的流出液；所述偶聯緩沖液組成為：0.1mol/L?Tris-HCl、150mmol/L?NaCl、1mmol/L?CaCl₂、1mmol/L?MgCl₂、1mmol/L?MnCl₂，pH7.4；

加入500μg?ConA于37℃靜置孵育3h，14000g離心10min，加入用150μL的40mMNH₄HCO₃至超濾管中，14000g離心10min重復加入NH₄HCO₃并離心3次，棄去收集管中的流出液，換新的收集管；加入用300μL的40mM?NH₄HCO₃溶解的PNGase?F充分混勻，37℃靜置孵育12h，14000g離心10min，加200μL超純水至超濾管中，14000g離心10min，重復加入超純水并離心一次，收集流出液，冷凍干燥得到非高甘露糖型N-糖鏈。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，高甘露糖型N-糖鏈的分離、富集采用如下具體步驟：

向原超濾管中加入300μL0.5Mα-甲基-甘露糖洗脫液，于37℃靜置孵育3h，14000g離心10min，加200μL超純水至超濾管中，14000g離心10min，重復加入超純水并離心一次，收集流出液，冷凍干燥得到高甘露糖型N-糖鏈。