[發(fā)明專利]一種與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢測引物及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410289345.3
• 申請日: 2014-06-24
• 公開（公告）號: CN104099415A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何毛賢;李琴
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院南海海洋研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于水產(chǎn)動物遺傳及分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢測引物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

馬氏珠母貝是我國及世界上海水珍珠養(yǎng)殖的主要物種。我國自1965年成功地開展了馬氏珠母貝人工育苗以來，海水珍珠產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，已成為廣東、廣西及海南部分沿海地區(qū)海水養(yǎng)殖支柱產(chǎn)業(yè)之一。近10多年，我國海水珍珠的質(zhì)量和產(chǎn)量明顯下降，國際競爭力減弱，養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益下滑。就其原因，除了養(yǎng)殖環(huán)境惡化、養(yǎng)殖技術(shù)落后外，還有一個重要原因是：多年來不注重種貝的選育和保留，缺乏優(yōu)良品種；種苗質(zhì)量參差不齊，育珠母貝性狀退化，如生長慢、個體小型、育珠能力減弱等。為了我國海水珍珠養(yǎng)殖業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展，培育適合我國海區(qū)養(yǎng)殖的馬氏珠母貝優(yōu)良品種已迫在眉睫。

育種技術(shù)有雜交、選擇育種，生物技術(shù)育種及分子育種等多種方法。分子育種是目前國內(nèi)外研究的熱點，是育種技術(shù)發(fā)展的主要方向，它具有高效、快捷的特點。分子育種離不開分子標(biāo)記的開發(fā)，用在海洋貝類遺傳育種研究的分子標(biāo)記主要有限制片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)、錨定簡單重復(fù)序列(ISSR)、簡單重復(fù)序列(SSR)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)、線粒體DNA(mtDNA)、核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)標(biāo)記(ITS)分子標(biāo)記等。Qiu等對合浦珠母貝不同群體進(jìn)行EST-SSR標(biāo)記與生長及珍珠層性狀的關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明在野生群體中基因PmartE05、PmartE35與殼高、總重顯著相關(guān)，基因PmartE64與珍珠層厚度顯著相關(guān)，在養(yǎng)殖群體中發(fā)現(xiàn)基因PmartE05與殼高顯著的相關(guān)。Cong等利用SNP標(biāo)記研究太平洋牡蠣的胰島素相關(guān)多肽基因(oIRP)的多態(tài)性與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)在oIRP基因1.5kb處發(fā)現(xiàn)31個SNPs，其中6個與生長性狀顯著相關(guān)，特別是標(biāo)記T1358G和標(biāo)記G1437A與殼高、殼長、殼寬、總重、軟體部重5個生長性狀顯著相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢測引物。

本發(fā)明的與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢測引物，其特征在于，包括：

ASSN815FI：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA；

ASSN815RI：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC；

ASSN815FO：TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT；

ASSN815RO：AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，其特征在于，其特異性檢測引物為：

ASSN815FI：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA；

ASSN815RI：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC；

ASSN815FO：TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT；

ASSN815RO：AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。

本發(fā)明的第三個目的是提供與馬氏珠母貝閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記在鑒定馬氏珠母貝閉殼肌重大小中的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟：

a、提取馬氏珠母貝樣品基因組DNA；

b、采用上述引物ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815FO、ASSN815RO對馬氏珠母貝樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

c、根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對馬氏珠母貝樣品進(jìn)行鑒定，當(dāng)出現(xiàn)具有207bp和180bp大小2條帶的為AG型，個體為閉殼肌重小的樣品；當(dāng)只出現(xiàn)180bp大小1條帶的為GG型，個體為閉殼肌重大的個體。

優(yōu)選，所述的PCR擴(kuò)增，其PCR反應(yīng)體系為：12.5μL?PCR反應(yīng)體系如下：包含馬氏珠母貝樣品基因組DNA40ng，1×PCR?Mixture，引物ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815FO、ASSN815RO各0.5μM，0.125U?Taq?DNA酶，余量為水；反應(yīng)條件為：94℃，5min；94℃35s，62℃40s；72℃40s，5個循環(huán)；94℃35s，60℃40s，72℃40s，15個循環(huán)；94℃35s，58℃40s，72℃40s，15個循環(huán)：72℃延伸10min。