[發(fā)明專利]一種利用混合纖維素酶粗酶液水解木質(zhì)纖維素發(fā)酵制備正丁醇的方法

有效

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• 申請日: 2014-06-24
• 公開（公告）號: CN104004794A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發(fā)明（設計）人: 楊謙;王震宇;曹廣麗;宋金柱;趙磊;馮麗平
• 申請（專利權(quán)）人: 哈爾濱工業(yè)大學
• 主分類號: C12P7/16
• 分類號: C12P7/16;C12P19/14;C12R1/145;C12R1/885;C12R1/685
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 侯靜

技術領域

本發(fā)明涉及一種混合纖維素酶粗酶液水解木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)正丁醇的方法。

背景技術

目前，世界能源需求主要由化石燃料滿足。然而，化石燃料資源枯竭一直是困擾人類社會可持續(xù)發(fā)展的一大重要因素，隨著科技的發(fā)展，人類越來越依賴能源來開展生產(chǎn)生活活動，這種影響近年來尤為明顯，對有限的能源資源的需求與日俱增，因此，開發(fā)一種新型能源勢在必行。正丁醇作為一種新型能源載體，其與汽油互溶性好，并可直接應用于現(xiàn)有發(fā)動機，具有較高的能量密度，辛烷值接近汽油，且親水性較差，便于運輸?shù)葍?yōu)點，被稱為新一代生物能源。生產(chǎn)正丁醇的方法有很多種，石油加工法目前應用最廣、成本也較低，但是其受制于石油資源的枯竭具有不可持續(xù)性；而生物發(fā)酵法生產(chǎn)正丁醇技術以其可持續(xù)性和發(fā)酵過程節(jié)能環(huán)保，受到廣泛的關注。為了使生物發(fā)酵生產(chǎn)正丁醇更具經(jīng)濟競爭力，尋求一種可再生且廉價的基質(zhì)是關鍵。木質(zhì)纖維素原料，如農(nóng)業(yè)廢棄物，是地球上最廉價、最豐富的可再生資源之一。亞洲國家具有巨大的利用農(nóng)業(yè)廢棄物生物發(fā)酵生產(chǎn)正丁醇的潛力，僅我國每年農(nóng)業(yè)廢棄物(玉米秸稈、稻草和麥秸等)的產(chǎn)量可達7億噸左右，能量相當于5億噸標煤。如果能將這些生物質(zhì)資源有效利用起來，有目的性地降解，并進一步轉(zhuǎn)化為丁醇，這將極大的降低生產(chǎn)丁醇的成本，使大規(guī)模并產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)燃油丁醇成為可能，這將在一定程度上緩解當前緊張的能源短缺局面。

由于秸稈表層蠟質(zhì)的保護作用、木質(zhì)素和半纖維素的空間障礙效應以及纖維素的高結(jié)晶度和聚合度影響秸稈的生物轉(zhuǎn)化效率。因此，要充分有效利用農(nóng)作物秸稈資源，就必須對秸稈進行預處理，破壞秸稈的表層蠟質(zhì)、木質(zhì)素-半纖維素的共價結(jié)合、纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)等，使纖維素與木質(zhì)素及半纖維素相互分離，增加纖維素分子與微生物或酶的接觸概率，實現(xiàn)提高秸稈生物轉(zhuǎn)化效率的目的。生物酶法水解因其反應條件溫和、酶促反應的特異性與高效性受到青睞。但是在生物酶法水解的過程中所用的纖維素商品酶制備過程復雜、保存條件嚴格、價格較高，會進一步提高生物發(fā)酵生產(chǎn)正丁醇的成本。

生物酶法降解木質(zhì)纖維素是一個酶系各組分相互協(xié)同作用最后達到降解效果的過程：內(nèi)切葡聚糖酶能夠附著在纖維絲表面切斷纖維素的分子鏈，外切葡聚糖酶則在纖維素分子鏈兩端進行切割形成葡萄糖或纖維二糖，最后β-1,4-葡萄糖苷酶能夠?qū)⒗w維二糖分解形成葡萄糖。在這一過程中各種酶相互協(xié)調(diào)的效果取決于各組分的酶活力以及該組分在整體酶系中的比例。而由于不同菌種中纖維素酶系各組分表達的差異性，在纖維素酶系的生產(chǎn)過程中往往幾種酶的活力及產(chǎn)量配比是無法協(xié)調(diào)發(fā)揮最大效率的。如常見的纖維素酶生產(chǎn)菌株綠色木霉，其纖維素酶系中β-1,4-葡萄糖苷酶活性較低，結(jié)果會造成在其纖維素水解產(chǎn)物中纖維二糖的大量積累，這不但會降低其纖維素的降解效率，更對接下來水解液的進一步發(fā)酵應用產(chǎn)生不利影響；再如另一常見纖維素降解真菌黑曲霉中，若僅僅β-1,4-葡萄糖苷酶具有較高酶活，但其內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶活力不足以降解纖維素產(chǎn)生足夠的纖維二糖，對黑曲霉降解纖維素的整體效率沒有幫助。因此多種菌株纖維素酶的混合粗酶液水解纖維素能夠明顯改善整體纖維素酶系中各組分酶的協(xié)調(diào)比例，最終提高整體的纖維素降解能力，有利于降低纖維素發(fā)酵生產(chǎn)正丁醇的生產(chǎn)成本。但目前沒有一組有效的多種菌株有效生產(chǎn)正丁醇的方案。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決現(xiàn)有生物發(fā)酵生產(chǎn)正丁醇過程中底物成本高，木質(zhì)纖維素水解過程中商品酶的應用造成成本上升，以及單一菌種纖維素酶系比例失衡造成的酶活降低等問題。從而提供一種利用混合纖維素酶粗酶液水解木質(zhì)纖維素發(fā)酵制備正丁醇的方法。

本發(fā)明的一種利用混合纖維素酶粗酶液水解木質(zhì)纖維素發(fā)酵制備正丁醇的方法，是按以下步驟實現(xiàn)：

一、對木質(zhì)纖維素采用堿預處理：木質(zhì)纖維素與質(zhì)量百分含量為2％的氫氧化鈉溶液按質(zhì)量比為1:9的比例混合，得混合溶液，將混合溶液在100℃條件下處理2h，然后將混合溶液經(jīng)蒸餾水洗滌至pH為中性并在105℃條件下烘干至恒重，得到的殘余固體即為預處理的木質(zhì)纖維素；

二、混合粗酶液的獲得：將綠色木霉和黑曲霉分別在好氧條件下采用液體發(fā)酵的方法獲得綠色木霉纖維素酶粗酶液和黑曲霉纖維素酶粗酶液；然后將綠色木霉纖維素酶粗酶液和黑曲霉纖維素酶粗酶液按體積比為2～4:1的比例混合，得到混合纖維素酶粗酶液；