[發(fā)明專利]樹蛙防御肽PopuDef及其基因和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410288772.X
• 申請(qǐng)日: 2014-06-25
• 公開（公告）號(hào): CN104031135A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊海龍;武靜;呂靖;韓毅;劉彤;孫曉華;木麗仙
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 昆明醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/435
• 分類號(hào): C07K14/435;C12N15/12;A61K38/17;A61P31/04
• 代理公司: 昆明今威專利商標(biāo)代理有限公司 53115
• 代理人: 楊宏珍

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種樹蛙(Polypedates?puerensis)防御肽PopuDef及其基因和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

抗生素廣泛用于治療敏感微生物(常為細(xì)菌或真菌)所致的感染。但是，由于人們對(duì)這些“傳統(tǒng)抗生素”的不合理使用、甚至濫用，導(dǎo)致許多細(xì)菌對(duì)它們產(chǎn)生了耐藥性。于是人們開始尋找新的抗微生物替代藥物。近年來的研究發(fā)現(xiàn),多肽類抗生素不但具有廣譜的抗微生物活性,同時(shí)具有“傳統(tǒng)抗生素”無法比擬的優(yōu)越性：在很低的濃度時(shí)，就可以快速地殺死各種細(xì)菌(含臨床耐藥性菌株)；對(duì)真菌和病毒也有抑制作用；微生物不易產(chǎn)生耐藥性；對(duì)于局部感染和全身感染都有效，有希望成為新一代抗微生物藥物。目前，對(duì)多肽類抗微生物藥物的研制受到了日益廣泛的重視。

許多兩棲動(dòng)物被廣泛應(yīng)用在傳統(tǒng)中藥和民族藥物中，如中華蟾蜍Bufo?gargarizans和滇蛙Rana?pleuraden等。近年來的研究表明，這些兩棲類動(dòng)物的皮膚分泌物具有廣泛的藥理活性，如抗微生物、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、創(chuàng)傷修復(fù)、鎮(zhèn)痛作用等。目前，從兩棲動(dòng)物皮膚中篩選一些藥理活性單體化合物是新藥發(fā)明的熱點(diǎn)。據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，已從各種生物來源分離得到不同的活性多肽，而且有些已進(jìn)入臨床階段。雖然我國對(duì)兩棲動(dòng)物應(yīng)用有著悠久的歷史，但是都是整體入藥，對(duì)其活性成分和藥理性質(zhì)的研究比較薄弱。樹蛙Polypedates?puerensis?主要分布于四川、云南省，是我國特色資源動(dòng)物之一,其皮膚分泌物中的活性物質(zhì)成分尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的在于提供一種新的具有廣譜抗微生物(包括革蘭氏陰、陽性細(xì)菌)的樹蛙防御肽及其基因和應(yīng)用。

本發(fā)明的樹蛙防御肽PopuDef是中國兩棲類樹蛙防御肽基因編碼的一種環(huán)狀多肽，分子量4636.12道爾頓，等電點(diǎn)4.75，多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)(氨基酸序列SEQ?ID?NO:1)為：

Gly?Ala?Ser?Pro?Ala?Leu?Trp?Gly?Cys?Asp?Ser?Phe?Leu?Gly?Tyr?Cys?Arg?Ile?Ala?Cys?Phe?Ala?His?Glu?Ala?Ser?Val?Gly?Gln?Lys?Asp?Cys?Ala?Glu?Gly?Met?Ile?Cys?Cys?Leu?Pro?Asn?Val?Phe(GASPALWGCDSFLGYCRIACFAHEASVGQKDCAEGMICC?LPNVF)，其第九位半胱氨酸和第三十八位半胱氨酸組成分子內(nèi)二硫鍵，第十六位半胱氨酸和第三十二位半胱氨酸組成分子內(nèi)二硫鍵，其第二十位半胱氨酸和第三十九位半胱氨酸組成分子內(nèi)二硫鍵。

編碼樹蛙防御肽的基因由401個(gè)核苷酸(SEQ?ID?NO:2)組成，其自5’端至3’端序列為:

編碼樹蛙防御肽的基因，其成熟樹蛙防御肽為SEQ?ID?NO:2的第67-198位核苷酸，其氨基酸序列(SEQ?ID?NO:3)為：

本發(fā)明的樹蛙防御肽作為制備病原微生物感染疾病的治療藥物的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：提供一種新的具有廣譜抗微生物(包括革蘭氏陰、陽性細(xì)菌)的樹蛙防御肽，該樹蛙防御肽具有顯著的抑制細(xì)菌生長的作用，能夠作為制備病原微生物感染疾病的治療藥物的應(yīng)用。

附圖說明：

附圖顯示樹蛙防御肽PopuDef的分離純化。箭頭所示為純化的防御肽PopuDef。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明。

1、樹蛙防御肽PopuDef的制備和氨基酸序列測(cè)定：

(1)、樹蛙皮膚勻漿：

活體樹蛙用水清洗干凈，剝離皮膚組織，稱重，取2g皮膚組織，加入10ml0.1M?pH6.0的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，于20ml玻璃勻漿器中勻漿。勻漿液于4℃條件下12000rpm離心15分鐘，上清于-80℃保存。

(2)、樹蛙防御肽PopuDef的分離純化：

以上述收集的上清液為原料，按照下述程序純化防御肽PopuDef，分離純化的每個(gè)組分都進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)，具體方法如下：

A.采用美國Millipore公司的超濾管將上清液中分子量大于10kDa的物質(zhì)去除。上清液加入超濾管(10kDa，15ml)中進(jìn)行第一次離心(3000×g，40分鐘)，收集濾液，再進(jìn)行第二次離心(3000×g，10分鐘)，收集濾液，再進(jìn)行第三次離心(3000×g，5分鐘)，收集剩余的濾液，于-20℃保存。