[發明專利]一種促進大鼠神經干細胞分化的培養基及其使用方法

有效

• 申請號: 201410288590.2
• 申請日: 2014-06-24
• 公開（公告）號: CN104017771A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 李志遠;鄧思浩;薛志琴;賀旭;鐘小林;胡杏
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所 43114
• 代理人: 袁靖

技術領域

本發明屬于神經干細胞培養分化的技術領域，具體涉及一種促進大鼠神經干細胞分化的培養基及其使用方法。

背景技術

傳統觀點普遍認為，中樞神經系統的自我修復能力有限，損傷后的神經元將不能再生。盡管如此，全世界的學者們都在努力試圖挑戰這種傳統的觀念。自從Reynolds和Weiss在20世紀90年代從小鼠的紋狀體組織中分離、培養出神經干細胞以來，人們不僅從各類動物及人的胚胎，而且從成年動物及人的中樞神經系統組織內分離、培養出了神經干細胞，并且證明其具有很強的增殖及自我更新能力，打破了這一傳統觀念。學術界目前將神經干細胞的特性概括描述為一類具有增殖、自我更新和多向分化潛能力的母細胞，它通過不對等的分裂方式進行增殖，并且根據培養條件的不同，可分化出神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞等神經組織的各類細胞。

神經干細胞向神經細胞的分化不僅可以應用于臨床治療各種神經系統的疾病，如帕金森癥、腦卒中、脊髓病變等；另外也可以作為體外研究哺乳動物神經系統發育的模型，不但能獲得均勻大量的細胞,而且能控制增殖速度和分化方向,易與宿主細胞形成正常的細胞聯系。目前基于神經細胞的替代療法主要有兩類，一類是通過調控體內神經干細胞的增殖分化來實現；另一類是通過神經干細胞移植來替代丟失的神經組織。大腦損傷后，新生的神經元數量非常少，而且可能不具有功能，不能整合到宿主的大腦環路中。這時候可以選擇移植神經干細胞到損傷區域，使其定向分化成神經元，但是，移植的細胞面臨著同樣的問題，那就是神經元樣分化、成熟以及如何整合到宿主的神經功能網絡中。因此，如何誘導神經干細胞增生并分化為神經元，提高神經干細胞分化成神經元的效率成為干細胞移植前非常關鍵的基礎。

發明內容

本發明的目的是提供一種促進大鼠神經干細胞分化的培養基及其使用方法，解決現有的神經干細胞分化效率低的問題，提高神經干細胞分化成神經元的效率。

一種促進大鼠神經干細胞分化的培養基，是在Neurobasal-A?medium中含有

所述的促進大鼠神經干細胞分化的培養基，優選是在Neurobasal-A?medium中含有

所述的促進大鼠神經干細胞分化的培養基的使用方法，初始狀態的細胞數為5×10⁵-2×10⁶個細胞/ml培養液，37℃、5％CO₂條件下進行培養，分化培養時間為5-7天，培養過程中隔天半量換液。

上述使用時是在25cm²培養瓶中培養基用量為5-6ml。

本發明從新生大鼠分離出腦組織，培養出神經干細胞，然后用一種成本較低，分化效率高的培養基誘導神經干細胞分化，并用免疫熒光化學染色方法予以鑒定，進行細胞計數后明確該培養基具有很高的體外誘導神經干細胞分化的效率。

附圖說明

圖1為神經原代細胞培養圖；

圖2為神經球nestin免疫熒光染色鑒定結果；

圖3為本發明培養基培養后分化的神經干細胞。

具體實施方式

以下結合具體實施方式旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。

1)神經干細胞完全培養基的配制：

100ml?Neurobasal-A?medium神經干細胞專用培養基中含有以下組分：

B-27Supplement?B27添加物???????????2ml??(終濃度2％體積比)；

L-Glutamine谷氨酰胺????(母液濃度為200mM)1ml??(終濃度2mM)；

EGF????表皮生長因子??(母液濃度為100μg/ml)20μl??(終濃度50ng/ml)；

bFGF堿性成纖維細胞生長因子(母液濃度為25μg/ml)80μl?(終濃度50ng/ml)；

肝素鈉???????????????(母液濃度為5mg/ml)??100μl??(終濃度50μg/ml)；

先配好母液，-20度保存，然后每次配制的時候再加到終濃度。