[發明專利]甘藍型油菜小孢子培養胚狀體的低溫越夏保存培養方法

無效

• 申請號: 201410287443.3
• 申請日: 2014-06-25
• 公開（公告）號: CN104145812A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 李超;林茂
• 申請（專利權）人: 貴州省油料研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 李亮;程新敏

技術領域

本發明涉及農業種植領域，尤其是一種甘藍型油菜小孢子培養胚狀體的低溫越夏保存培養方法。

背景技術

甘藍型油菜Brassica?napus?L是三種油用油菜（白菜型油菜、芥菜型油菜、甘藍型油菜）中籽粒產量最高的種類，目前在我國長江游流域大量種植，是我國最重要的油料作物。

正常情況下，甘藍型油菜的小孢子產胚以后，胚狀體接種到MS?固體培養基上，需要在培養瓶中每30-45天繼代一次。從3月到10月，最少需要繼代4次。夏季的污染會造成大量的苗損失，同時也是時間、勞力和財力的大量浪費。如接種10000個胚，按照10個胚/瓶進行接種，每次接種需要1000個培養瓶，50000ml培養基（每瓶50mL），1個工作日才能完成。

發明內容

本發明的目的是：提供一種甘藍型油菜小孢子培養胚狀體的低溫越夏保存培養方法，以解決現有技術中甘藍型油菜小孢子培養胚狀體或苗越夏難的問題。

本發明是這樣實現的：甘藍型油菜小孢子培養胚狀體的低溫越夏保存培養方法，將游離小孢子在NLN-13培養基中培養25～28天后，獲得胚齡為25～28天的胚狀體，將得到的胚狀體置于新的NLN-13培養基中，并將新的NLN-13培養基的PH降低為5.5，然后將放置在3℃的冰箱中保存15～150天；期間每60天更換一次NLN培養基，第一個60天用NLN-13培養基，之后都用NLN-10培養基，PH為5.5。

將其在3℃的冰箱中保存15～120天。

所述的胚狀體的培養密度是，在直徑為6cm的玻璃培養皿，每皿存放150～200個胚狀體。

當胚在3℃冰箱中保存60天后，培養基需要從NLN-13培養基更換為NLN-10培養基時，從NLN-13培養基更換為NLN-10培養基前，將胚狀體從3℃的低溫冰箱轉移8℃的培養箱中過度24小時，然后再取出更換為NLN-10培養基，并在8℃的培養箱中過度24小時，然后放置到3℃的冰箱中保存；之后每60天用同樣的方法進行換液，幻夜的培養基為NLN-10培養基。

為了進一步驗證本發明的實驗效果，進行了如下實驗：

將同一批游離小孢子培養在25～28天后獲得的胚狀體分組，并按照本發明的技術方案進行處理后，分別將它們放置到3℃的冰箱保存15天后，胚狀體開始變黃，如圖1和圖2所示；當從冰箱取出換成新的NLN-13培養基，見光培養3-5天后胚就立即轉變成綠色。在冰箱中保存的時間越長，胚的顏色越黃，但是這并不會影響胚的生長，當低溫保存90天左右，見光培養5天后胚就完全轉變成綠色，如圖3所示；當胚在低溫冰箱保存120d后，見光培養后可以明顯看見胚根較長，如圖4所示；當低溫保存150d后，胚的顏色完全變黃，如圖5所示，一旦見光培養5天以上，胚的顏色又轉為綠色，但是胚根很長。胚根伸長的表現，是由于胚在不斷發育生長，低溫抑制了營養體的生長，但是兩端的極性生長還在繼續。

因此，本發明的實驗表明，幼胚在3℃低溫冰箱中至少可以保存到150天左右，完全減少了夏季試管苗的多次繼代繁殖，避免了夏季試管苗難以移栽到大田的狀況，只要在需要移栽或者轉接胚時從冰箱中取出培養，然后誘導成苗，即可實現胚狀體苗的繁殖。但是，在冰箱中保存時間過長，胚根就會更加細而長，這不利于胚轉接到固體培養基上，也會降低胚的成苗率。因此，本發明認為胚在低溫冰箱中保存時間不宜超過120天。

正常情況下，小孢子產胚以后，胚狀體接種到MS?固體培養基上，需要在培養瓶中每30-45天繼代一次。從3月到10月，最少需要繼代4次。夏季的污染會造成大量的苗損失，同時也是時間、勞力和財力的大量浪費。如接種10000個胚，按照10個胚/瓶進行接種，每次接種需要1000個培養瓶，50000ml培養基（每瓶50mL），1個工作日才能完成。如果是采用低溫保存，則只需要用50個培養皿裝胚（200胚/皿），然后放到一個3℃冰箱就可以保存起來，只需要每隔60天更換一次培養液就可以，整個過程可以節約近5000元。

由于采用上述的技術方案，與現有技術相比，本發明將甘藍型油菜的游離小孢子進行培養，獲得適宜胚齡的胚狀體，將其在低溫下進行保存，從很大程度上節省了轉接時間、節約大量的轉接經費和人力資源，同時，也可以減少轉接過程中的污染率，較大程度提高了甘藍型油菜小孢子培養創新種質資源的效率，對于創新種質資源、尤其是特優和特異種質資源具有重要作用。本發明的方法簡單，容易實施，成本低廉，使用效果好。

附圖說明