[發明專利]一種花生根結線蟲檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201410285598.3
• 申請日: 2014-06-24
• 公開（公告）號: CN104046691A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 李永鋒;陳國勇;傅汝毅;陶玲云;藍文苑
• 申請（專利權）人: 廣西博士海意信息科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 李珊

技術領域

本發明涉及一種花生根結線蟲檢測試劑盒，屬于生物技術檢測領域。

背景技術

花生根結線蟲病（Peanut?Root?Knot?Nematode），俗稱地黃病、地落病、矮黃病、黃秧病等。二齡幼蟲侵入花生的幼嫩根尖，形成不規則形根結，線蟲鉆入花生根部中柱造成根液滲流，損耗養分，易引起次生病害。根結線蟲定居取食旱刺激根細胞增生，連續為害新根根尖，使次生根結成團（根結團），吸收養分困難。病株生長緩慢或萎黃不長，植株矮小，始花期葉片變黃瘦小，葉緣焦枯，提早脫落。花小且開花晚，結果少或不結果。線蟲還可侵害果殼、果柄和根頸，果殼受害形成乳白突起的小瘤，后蟲瘤呈褐色瘡痂狀，但較少見。果柄和根莖形成葡萄狀蟲瘤簇。

花生根結線蟲病發生的輕重主要受土壤溫濕度、土質和栽培管理條件的影響。土壤溫度和濕度對幼蟲侵染影響很大。幼蟲侵染的溫度范圍為12～34℃，最適為20～26℃。土壤含水量在20%以下和90%以上都不利于幼蟲侵入，最適侵入的土壤含水量為70%左右，但從為害程度來看，雨水少、灌溉不及時為害重，雨水多或灌溉及時為害輕。土質疏松的砂壤土和砂土地發病重，黏土和低洼堿性土壤發病輕，甚至不發病。輪作田發病輕，連作田發病重。春花生比麥茬花生發病重，早播比晚播發病重。田間寄主雜草及病殘體多的發病重。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于花生根結線蟲檢測試劑盒，主要解決現有技術存在的靈敏度低、穩定性差、操作煩瑣及污染環境等技術問題。

本發明的技術方案是：一種花生根結線蟲檢測試劑盒?，主要包括無Mg2+的10×PCR緩沖液，濃度為25mM的Mgcl2溶液，濃度為0.1mM的dNTP溶液，濃度5U/μl的taq酶溶液，濃度都為10μM?的上游引物溶液和下游引物溶液，所述的上游引物溶液和下游引物溶液包含一堆特異性引物，所述的一對特異性義務的核苷酸序列分別為：

上游引物5^，-GTGAGGATTCAGCTCCCCAG-3^，

下游引物5^，-CAAGACCCAATGGCCATAGG-3^，

????該特異性引物對花生根結線蟲擴增的特異性片段大小為799bp。

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具體實施方式：

實施例1：一種花生根結線蟲檢測試劑盒?。

主要包括無Mg²⁺的10×PCR緩沖液，濃度為25mM的Mgcl₂溶液，濃度為0.1mM的dNTP溶液，濃度5U/μl的taq酶溶液，濃度都為10μM?的上游引物溶液和下游引物溶液，:的上游引物溶液和下游引物溶液包含一堆特異性引物，一對特異性義務的核苷酸序列分別為：上游引物5^，-GTGAGGATTCAGCTCCCCAG-3^，，下游引物5^，-CAAGACCCAATGGCCATAGG-3^，。

實施例2：DNA的提取

調取單條線蟲放入200μlPCR管中（已加有10μl雙蒸水和5μl?10×PCR緩沖液（無Mg²⁺）），液氮中放置1min（或-70度放置0.5h）以上，取出后立即85℃加熱2min。然后向PCR管中加入1μl?1mg/ml蛋白酶K，56℃加熱30min以上，95℃加熱10min，得到DNA模板。

實施例3：PCR檢測

用本發明所述試劑盒進行檢測，PCR發應體系為：無Mg²⁺的10×PCR緩沖液5.0μl，濃度為25mM的Mgcl₂溶液5.0μl，濃度為0.1mM的上游引物溶液和下游引物溶液各3.0μl，DNA模板1.0~5.0μl，ddH₂O補齊50μl。PCR發應條件：94℃?4?min；94℃?40?sec，52℃?1?min，72℃?1.5?min，36個循環；72℃?8?min。電泳：將5ulPCR產物用1.0%（重量/體積）瓊脂糖凝膠電泳分離，經DNA染料染色后與紫外凝膠成像系統下現象，出現特異性片段大小為799bp，則為花生根結線蟲。