[發明專利]一種促凋亡重組卡介苗及其制備方法

有效

• 申請號: 201410283903.5
• 申請日: 2014-06-24
• 公開（公告）號: CN104107427A
• 公開（公告）日: 2014-10-22
• 發明（設計）人: 王洪海;李光華;徐穎;劉國元;宋娜;孔聰;黃琪
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: A61K39/04
• 分類號: A61K39/04;A61K48/00;C12N15/74;C12N15/31;C12N1/21;A61P31/06;A61P37/04
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;王潔平

技術領域

本發明涉及遺傳工程和結核病疫苗研究領域，具體涉及一種促凋亡重組卡介苗及其制備方法。

背景技術

全球三分之一的人口已經感染結+核分枝桿菌。卡介苗（BCG）是目前唯一可用的抗結核病疫苗。雖然BCG能有效預防嬰幼兒結核性腦膜炎和粟粒性肺結核，但BCG對成人肺結核的預防保護效果為0-80%。盡管使用BCG已經90多年，每年仍有130萬人死于結核病。而且耐多藥結核病（MDR-TB）、廣泛耐藥結核病(XDR-TB)和HIV-TB共感染使全球結核病防治形勢更加嚴峻。

BCG對幼兒預防結核病具有明顯保護效果，而且價格低廉，安全性已得到多年實踐證明，因此，將現有的BCG進行改造以獲得更好的保護效果是一條明智的策略。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種促凋亡重組卡介苗及其制備方法；與BCG相比，本發明所獲得的重組卡介苗具有較強的誘導巨噬細胞發生凋亡的能力，有望提高機體對結核分枝桿菌的免疫力。

本發明提供一種促凋亡重組卡介苗，其通過在大腸桿菌—分枝桿菌穿梭質粒pMV261中依次插入結核保護性抗原Ag85B的信號肽ASP和促細胞凋亡基因BAX先得到重組質粒pMV261—ASP—BAX,再將重組質粒pMV261—ASP—BAX電轉入BCG而獲得，記為rBCG::ASP—BAX。?

本發明還提供一種促凋亡重組卡介苗的制備方法，具體步驟如下：

（1）分別PCR擴增Ag85B的信號肽ASP和Bax基因；

（2）用同樣的核酸內切酶對Ag85B的信號肽ASP和質粒pMV261進行雙酶

切，再用T4?DNA連接酶進行連接形成重組質粒pMV261—ASP；

（3）將步驟（2）獲得的重組質粒進行測序，測序正確后，轉化，克隆；

（4）抽提步驟（3）獲得的重組質粒，用同樣的核酸內切酶對Bax和重組

質粒pMV261—ASP雙酶切，再用T4?DNA連接酶進行連接形成重組質粒pMV261—ASP—BAX。

（5）將步驟（4）獲得的重組質粒pMV261—ASP—BAX通過電脈沖轉移

系統轉入BCG中，形成重組卡介苗rBCG::ASP—BAX。

上述步驟（2）和步驟（4）中所述核酸內切酶是EcoRI和Hind?III。

上述步驟（2）和步驟（4）中所述核酸內切酶是Hind?III和Sal?I?。

本發明中，用重組卡介苗rBCG::ASP—BAX免疫C57BL/6小鼠，研究結果證實該重組卡介苗在刺激機體產生IFN-γ、TNF-α和Th1免疫反應特征性細胞因子IL-2方面均優于BCG；刺激機體產生Th2免疫反應特征性細胞因子IL-4的量顯著低于BCG，而血清抗體亞型IgG2b/IgG1比例高于BCG，表明與BCG相比，重組卡介苗在誘導機體產生以Th1為主導的細胞免疫方面更具有潛力，利于形成抗結核分枝桿菌的免疫保護力。另一方面，重組卡介苗接種后只被特異的巨噬細胞吞噬，因此分泌的促凋亡蛋白BAX不會對其他組織細胞產生凋亡作用，從而保證了該促凋亡重組卡介苗的安全性。因此，本發明的重組卡介苗有望成為新的有效抗結核疫苗。

附圖說明

圖1??重組質粒pMV261—ASP—Bax構建模式圖;?將目的基因ASP和bax?酶切并連接到大腸桿菌—結核分枝桿菌穿梭質粒pMV261中，構建重組質粒pMV261—ASP—Bax。

圖2??酶切鑒定重組質粒pMV261—ASP—Bax（1.5%?瓊脂糖凝膠電泳）泳道1:DNA?Marker;??泳道2:ASP?PCR產物;??泳道3:bax?PCR產物;?泳道4:重組質粒pMV261-ASP-bax;??泳道5:重組質粒pMV261-ASP-bax酶切驗證ASP;??泳道6:重組質粒pMV261-ASP-bax酶切驗證bax;?泳道7:質粒pMV261。

圖3??以重組BCG菌液為模板PCR鑒定重組卡介苗rBCG?::?ASP—Bax（1.5%?瓊脂糖凝膠電泳）泳道1:?DNA?Marker;?泳道2:ASP?PCR產物;?泳道3:bax?PCR產物;?泳道4:?以rBCG?::?ASP—Bax為模板PCR擴增的ASP—bax?融合基因產物;?泳道5:?以重組質粒pMV261-ASP-bax為模板PCR擴增的ASP-bax融合基因產物。