[發明專利]適于家蠶中部絲腺表達的雞傳染性法氏囊病病毒結構蛋白VP2及其表達載體和應用

有效

• 申請號: 201410280164.4
• 申請日: 2014-06-20
• 公開（公告）號: CN104017814A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 趙萍;袁林;王峰;徐漢福;夏慶友
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/40
• 分類號: C12N15/40;C07K14/08;C12N15/85;C12R1/93
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 王貴君

技術領域

本發明屬于基因工程領域，特別涉及適于家蠶中部絲腺表達的雞傳染性法氏囊病病毒結構蛋白VP2，還涉及表達雞傳染性法氏囊病病毒結構蛋白VP2的表達載體和利用家蠶中部絲腺表達雞傳染性法氏囊病病毒結構蛋白VP2的方法。?

背景技術

雞傳染性法氏囊病(Infectious?Bursal?Disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious?Bursal?Disease?virus，IBDV)引起的以主要侵害雛雞中樞免疫器官——法氏囊的傳染病。該病可導致機體免疫抑制甚至個體死亡，并造成雞群對其它病原的易感性增強和免疫失敗，給養禽業帶來了巨大的經濟損失。近年來，世界多個國家或地區均發現了毒力更強、可逃避現行疫苗保護的IBDV變異株，使IBD的流行和防控更為復雜和困難。利用基因工程技術生產亞單位疫苗是防治畜禽疾病的重要方向和有效手段，可有效避免因傳統滅活或弱毒IBDV疫苗無法識別的風險。VP2蛋白是IBDV的主要結構蛋白，含有病毒的主要抗原保護性位點，是開發亞單位疫苗的首選靶標。目前，研究人員利用大腸桿菌、酵母、重組病毒和水稻等表達系統，已成功表達了雞傳染性法氏囊病病毒結構蛋白VP2，并證實能有效刺激中和抗體的產生，對雞預防感染IBDV起到不同程度的保護效果。?

家蠶是著名經濟昆蟲，自被人類飼養馴化至今主要用于取絲織綢，為我國的經濟發展做出了巨大貢獻。家蠶絲腺是合成和分泌蠶絲蛋白的器官，具有強大的蛋白合成和分泌能力，從蟻蠶到熟蠶，絲腺的重量增加了16萬倍，其重量占蠶體重量從4齡以下的5％，到5齡中期迅速增大，熟蠶時達到了40％～45％，成為蠶體內最大的器官。家蠶5齡中期以后絲腺中絲素蛋白的合成速度高達8mg/g﹒h。在脊椎動物中，小雞肝臟是合成白蛋白速度最高的器官，約0.1mg/g﹒h，絲腺的合成速度是其80倍。家蠶以其超強的蛋白質合成能力、飼養成本低、對人畜無毒無害、易規模化和工廠化生產等優勢，它被看作是一種極具潛力的優良生物反應器。但迄今尚無利用轉基因家蠶表達雞傳染性法氏囊病病毒結構蛋白VP2的方法和相關報道。?

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供適于家蠶中部絲腺表達的雞傳染性法氏囊病病毒?結構蛋白VP2；本發明的目的之二在于提供表達雞傳染性法氏囊病病毒結構蛋白VP2的表達載體；本發明的目的之三在于提供表達載體在家蠶中部絲腺表達雞傳染性法氏囊病病毒結構蛋白VP2中的應用；本發明的目的之四在于提供利用所述表達載體在家蠶中部絲腺表達雞傳染性法氏囊病病毒結構蛋白VP2的方法。?

為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：?

適于家蠶中部絲腺表達的雞傳染性法氏囊病病毒結構蛋白VP2，所述雞傳染性法氏囊病病毒結構蛋白VP2的基因序列如SEQ?ID?NO.1第7位至1329位所示。?

優選的，所述雞傳染性法氏囊病病毒結構蛋白VP2的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。?

2、在家蠶中表達所述雞傳染性法氏囊病病毒結構蛋白VP2的表達載體。?

優選的，所述表達載體含有順序連接的增強子hr3，分泌型絲膠1基因啟動子、雞傳染性法氏囊病病毒結構蛋白VP2基因和絲膠1基因的終止子。?

優選的，所述表達載體還含有熒光篩選標記基因表達框和piggyBac轉座臂序列，所述熒光篩選標記基因表達框位于所述增強子hr3上游，所述piggyBac轉座臂序列位于熒光篩選標記基因表達框與絲膠1基因的終止子之間。?

優選的，所述表達載體由SEQ?ID?NO.3所示的序列經AscI酶切后連入同樣經AscI酶切的、去磷酸化的pBac[3×p3-EGFPaf]轉基因表達載體制得。?

3、所述表達載體在家蠶中部絲腺表達雞傳染性法氏囊病病毒結構蛋白VP2中的應用。?

4、利用所述表達載體在家蠶中部絲腺表達雞傳染性法氏囊病病毒結構蛋白VP2的方法，包括如下步驟：將所述表達載體顯微注射家蠶蠶卵，用無毒膠水封口后置于25℃、相對濕度為90％的環境中孵化，篩選轉基因陽性蛾圈，取陽性轉基因家蠶繭殼，于液氮中粉碎成粉末，然后溶解于含20mM?Tris-Cl，8M?Urea，pH8.0的溶液中，15000rpm離心收集上清，經純化，得雞傳染性法氏囊病病毒結構蛋白VP2。?