[發(fā)明專利]草莓皺縮病毒的快速檢測試劑盒及方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410280094.2
• 申請日: 2014-06-20
• 公開（公告）號: CN104032036A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 尚巧霞;冉策;陳柳;陳笑瑜;邢冬梅;胡學(xué)軍;魏艷敏;劉正坪;韓成貴
• 申請（專利權(quán)）人: 北京農(nóng)學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及草莓皺縮病毒的RT-LAMP檢測引物組、檢測試劑盒及方法。

背景技術(shù)

草莓皺縮病毒(Strawberry?crinkle?virus,SCV)分類學(xué)上隸屬彈狀病毒科(Rhabdoviridae)細(xì)胞質(zhì)彈狀病毒屬(Cytorhabdovirus)。病毒粒體長約163-383nm，直徑74-78nm，單分體基因組，-ssRNA，長2291bp。1932年在美國俄勒岡州草莓品種Marshall上首次被報道，1949年W.Prentice把草莓病毒3(Strawberry?virus3)改名為皺縮病毒。病毒外殼由3個主要的結(jié)構(gòu)蛋白組成，大小分別為78、47、25kDa。病毒侵染寄主植物后，存在于寄主的葉肉、表皮、韌皮部組織及未成熟木質(zhì)部中，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池中形成病毒粒子聚集體。主要通過蚜蟲持久性方式和嫁接傳播，植株相互接觸、種子和花粉不傳播。該病毒在世界各地廣泛分布，并存在株系分化現(xiàn)象。

草莓皺縮病毒在草莓各栽培區(qū)分布較廣，危害較重。由于蚜蟲傳播等原因，病毒病害防治困難，因此，建立高效靈敏的檢測技術(shù)，成為解決種苗檢測、早期鑒定等問題的關(guān)鍵，為草莓栽培提供保障。草莓皺縮病毒的檢測技術(shù)目前包括指示植物的小葉嫁接法和反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)等。小葉嫁接法周期長、靈敏度較低，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測病毒靈敏度高，但需要特殊的儀器和試劑，檢測時間較長，很難在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)單位和技術(shù)推廣部門應(yīng)用檢測。

逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(Reverse?transcription?loop-mediated?isothermal?amplification,RT-LAMP)檢測病毒操作簡便，不需要特殊的儀器和試劑，操作簡單，可以在恒溫條件下快速檢測，不需要長時間的溫度循環(huán)和昂貴的儀器，尤其是反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)都能在恒定溫度下同時進(jìn)行，降低了檢測時間和成本。反應(yīng)完成后，還可以通過熒光染色可以直接觀察，能進(jìn)一步減少時間。逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)與其他病毒檢測方法相比，快速、簡便、靈敏，目前尚未有將逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)在草莓皺縮病毒檢測上的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供檢測草莓皺縮病毒(Strawberry?crinkle?virus,SCV)的專用引物以及特異性強(qiáng)、靈敏度高、易于操作、結(jié)果可靠的草莓皺縮病毒(Strawberry?crinkle?virus,SCV)的快速分子檢測試劑盒及方法。

本發(fā)明所提供的檢測草莓皺縮病毒(Strawberry?crinkle?virus,SCV)的專用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成。

本發(fā)明還提供一種檢測草莓皺縮病毒(Strawberry?crinkle?virus,SCV)的試劑盒，包括所述的專用引物。

本發(fā)明所述專用引物在制備檢測草莓皺縮病毒(Strawberry?crinkle?virus,SCV)的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍

上述專用引物或試劑盒在鑒定草莓皺縮病毒(Strawberry?crinkle?virus,SCV)病毒病中的應(yīng)用也是本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明還保護(hù)一種檢測草莓皺縮病毒(Strawberry?crinkle?virus,SCV)或檢測草莓草莓皺縮病毒(Strawberry?crinkle?virus,SCV)病害發(fā)生危害的方法，包括如下步驟：

(1)提取待測生物樣本的基因組RNA；

(2)以步驟(1)的基因組RNA為模板，用所述的專用引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增；

(3)根據(jù)步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定所述待測生物樣本是否含有草莓皺縮病毒(Strawberry?crinkle?virus,SCV)或者是否感染草莓皺縮病毒(Strawberry?crinkle?virus,SCV)病害。

所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃30分鐘，80℃10分鐘。

所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增的反應(yīng)體系中，序列表的序列1所示DNA和序列表的序列4所示DNA的濃度均為0.4μM，序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA的濃度均為0.2μM。