[發(fā)明專利]一種磷脂酶A2突變體及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410279966.3
• 申請日: 2014-06-20
• 公開（公告）號: CN104017786A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 路福平;劉逸寒;張濤;劉曉光;王正祥;王春霞;王建玲
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/75;C12N1/21;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/125;C12R1/84
• 代理公司: 北京鼎佳達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11348
• 代理人: 王偉鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種磷脂酶及其制備方法。本發(fā)明涉及通過重疊PCR技術(shù)體外定向進(jìn)化構(gòu)建的比酶活提高的磷脂酶A₂突變體，具體的說涉及到利用分子生物學(xué)技術(shù)獲得比酶活提高的磷脂酶A₂突變體，屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

磷脂酶A₂(Phospholipase?A₂，PLA₂)，是磷脂-2-酰基水解酶(EC3.1.1.4)，它催化甘油磷脂sn-2位酯鍵的水解反應(yīng)，生成溶血磷脂和脂肪酸，在磷脂分解代謝中有重要作用，此外某些來源的磷脂酶A₂具有催化磷脂sn-2位磷酸二脂酯鍵堿基交換的功能。

磷脂酶A₂廣泛存在于自然界，幾乎所有的生物細(xì)胞及亞細(xì)胞中都有這種酶。存在于細(xì)胞內(nèi)的磷脂酶A₂，濃度、酶活較低，但參與許多重要的生理代謝過程；存在于細(xì)胞外的磷脂酶A₂，含量高、活力強(qiáng)、易于富集純化，是工業(yè)商品磷脂酶A₂的主要來源。

磷脂酶A₂在多個領(lǐng)域具有應(yīng)用價值，1、用于溶血磷脂的制備：溶血磷脂在食品加工中可作為乳化分散劑、乳化劑使用，溶血磷脂添加在護(hù)膚化妝品中，能起到舒展皮膚皺紋，改善粗糙結(jié)構(gòu)的作用。2、用于油脂精煉：磷脂酶A₂可以將油脂中的磷脂轉(zhuǎn)化成易于溶解在水中的溶血磷脂，然后經(jīng)過離心即可除去油脂中的磷脂，以達(dá)到脫膠的目的。3、用于功能性磷脂的制備：由于某些磷脂酶A₂具有催化磷脂sn-2位磷酸二脂酯鍵堿基交換的功能，可以將不飽和脂肪酸(如二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸)整合在磷脂骨架中，從而提高磷脂的生理功能。

雖然磷脂酶A₂具有很多應(yīng)用價值，但距工業(yè)生產(chǎn)的需要，特別是與其他酶生產(chǎn)和應(yīng)用相比，存在很大的差距，主要原因是：1、酶源狹窄，目前磷脂酶A₂主要從動物胰臟、蛇毒、蜂毒中提取，也有從動物內(nèi)臟或微生物中提取磷脂酶A₂，但是工藝復(fù)雜，不利于磷脂酶A₂的大量生產(chǎn)和利用；2、該酶的作用機(jī)理尚未完全搞清，目前對其催化磷脂sn-2位磷酸二脂酯鍵水解的研究較多，而對催化磷脂sn-2位磷酸二脂酯鍵堿基交換的研究甚少。

酶分子體外定向進(jìn)化屬于蛋白質(zhì)的非理性設(shè)計(jì)，是蛋白質(zhì)工程的新策略。利用分子生物學(xué)手段在分子水平創(chuàng)造出分子的多樣性，結(jié)合靈敏的篩選技術(shù)，迅速得到理想的突變體。它不需事先了解蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)、催化機(jī)制等因素，而是人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制，在體外改造酶基因，獲得具有某些預(yù)期特征的改構(gòu)酶。定點(diǎn)突變就是在已知的DNA序列中插入、缺失或取代一定長度的核苷酸序列。該方法已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于基因表達(dá)的調(diào)控、基因結(jié)構(gòu)與功能及蛋白質(zhì)性質(zhì)等方面的研究。本發(fā)明所使用的定點(diǎn)突變的方法是重疊PCR技術(shù)，該技術(shù)可以簡單、快速的將兩個或多個基因片段通過末端互補(bǔ)、重疊延伸進(jìn)行體外基因的拼接。重疊PCR技術(shù)可以獲得依靠限制性內(nèi)切酶消化難以得到的產(chǎn)物，并且方便快速，在進(jìn)行大片段基因的定點(diǎn)突變、基因片段刪除以及多個編碼序列嵌合連接上具有獨(dú)有的優(yōu)勢。

枯草芽孢桿屬于革蘭氏陽性菌。枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)有以下優(yōu)點(diǎn)：1、能夠高效地分泌各種蛋白質(zhì)；2、許多枯草芽孢桿菌在發(fā)酵工業(yè)上的使用已有相當(dāng)長的歷史，無致病性，不產(chǎn)生任何內(nèi)毒素；3、芽孢桿菌屬微生物遺傳學(xué)背景研究的十分清楚，并具有生長迅速，對營養(yǎng)無特殊要求的優(yōu)點(diǎn)；4密碼子偏愛性不明顯；5發(fā)酵簡單，枯草芽孢桿菌是好氧菌，無需厭氧發(fā)酵設(shè)備，對培養(yǎng)基無特殊要求，發(fā)酵結(jié)束后，簡單地分離發(fā)酵液和細(xì)菌菌體，即可進(jìn)入目的蛋白的純化回收階段；6具有抗逆性，可生產(chǎn)多種耐熱性酶制劑。