[發明專利]EB1基因在檢測家蠶微孢子蟲中的應用

有效

• 申請號: 201410279223.6
• 申請日: 2014-06-20
• 公開（公告）號: CN104017890A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 劉吉平;晏育偉;程偉
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/90
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

技術領域

本發明涉及分子生物技術領域，更具體地，涉及EB1基因在檢測家蠶微孢子蟲中的應用。

背景技術

家蠶微粒子病是病原性的桑蠶微孢子蟲（Nosema?bombycis，N.b）經食下傳染或胚卵（胎）傳染，使家蠶感染發病的一種毀滅性疫病。也是目前影響我國蠶絲業持續穩定發展的重要疫病，每年各地蠶種生產因微粒子病危害而造成的經濟損失慘重。同時，野外昆蟲微孢子蟲可交叉感染家蠶，并能在蠶體間以及不同蠶期間傳播，導致大批蠶種報廢，嚴重制約蠶種貿易和蠶業可持續發展。各地區蠶業主管部門和相關生產單位投入大量人力、物力和財力，采取傳統顯微鏡鏡檢母蛾，淘汰帶毒母蛾產下蠶種的常規方法進行防治，但效果始終不佳。我國將家蠶微粒子病列為進出口動物檢疫二類疫病的檢疫名錄。

最初人們判別家蠶是否感染家蠶微粒子病主要根據顯微鏡下組織研磨液中的微孢子蟲的形態和大小進行的，這種方法也有效地遏制了世界各地蠶區微粒子病的流行，拯救了世界的養蠶業。但是顯微鏡鏡檢的缺點是對操作人員的技術及經驗要求較高，很難區分不同種屬的微孢子蟲及其類似物。隨著PCR技術的普及，人們開始使用PCR方法來檢測家蠶微孢子蟲并且達到了較高的靈敏度。目前用于家蠶微粒子病?PCR?檢測的引物多是針對靶基因SSUrRNA的（Terry?R?S,Smith?JE,?Bouchon?D,?et?al.?Ultrastructural?characterization?and?molecular?taxonomy?of?Nosema?granulosis?sp.?n.,?a?transovarially?transmitted,?feminizing?(TTF)?microsporidium.?J.?Eukaryot.?Microbiol.?1999,?(46):?492-499；?Huang?Wei-Fone?,?Tsai?Shu-Jen?,?Lo?Chu-Fang?,?et?al.?The?novel?organization?and?complete?sequence?of?the?ribosomal?RNA?gene?of?Nosema?bombycis?.Fungal?Genetics?and?Biology,?2004.41(5):?473-481?）但是劉吉平等（2004）（劉吉平，曹?陽，Smith?J.?E.等.?模擬感染家蠶微粒子病的?PCR?分子診斷技術研究.?中國農業科學，2004，37(12)：1925－1931）研究發現，基于16SrDNA保守區段設計的引物檢測蠶卵微孢子蟲，經常會有非目的條帶出現，推測蠶卵抽提物中可能存在某種抑制物質干擾了對病原基因DNA的PCR有效擴增。

發明內容

本發明為了克服現有技術中檢測蠶卵是否感染家蠶微孢子蟲所存在的上述缺陷，提供EB1基因在檢測家蠶蠶卵是否感染家蠶微孢子蟲中的應用。

本發明的另一個目的是提供一種檢測家蠶蠶卵是否感染家蠶微孢子蟲的引物組。

本發明的另一個目的是提供一種檢測家蠶蠶卵是否感染家蠶微孢子蟲的試劑盒。

?本發明的目的是通過以下技術方案予以實現：

本發明提供EB1基因在檢測家蠶蠶卵是否感染家蠶微孢子蟲中的應用。

本發明人在家蠶微孢子蟲N.?bombycis（廣東株）轉錄組學研究的基礎上，首次鑒定了可能與N.?bombycis侵染、繁殖相關的EB1基因，并對感染了家蠶微孢子蟲N.?bombycis的家蠶幼蟲、卵等不同發育階段的家蠶組織進行了EB1的表達差異分析。結果表明，EB1在感染家蠶的前2天基本無轉錄活性，從感染家蠶第3天到五齡熟蠶以及蠶卵發育前7天，均能檢測到EB1的轉錄表達活性；且在感病蠶卵前滯育階段，蠶卵胚胎中的EB1基因表達量呈逐漸下降的趨勢，在蠶卵剛產下來1?h時，其表達量最大，為Nb的1.86倍，隨后，隨著蠶卵胚胎的進一步發育，EB1的表達量逐步下降，在第7天時表達量最低，為Nb的0.12倍。推測N.?bombycis的EB1基因轉錄表達可能與家蠶微孢子蟲細胞分裂以及寄主的發育有關。