[發明專利]一種小麥WRKY轉錄因子基因在擬南芥應答高溫脅迫中的應用

有效

• 申請號: 201410276223.0
• 申請日: 2014-06-19
• 公開（公告）號: CN104046634B
• 公開（公告）日: 2017-02-22
• 發明（設計）人: 謝曉東;丁博;王俊斌;李明;陳帥君;郭雨
• 申請（專利權）人: 天津農學院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 天津市新天方有限責任專利代理事務所12104
• 代理人: 李桂英

技術領域

本發明屬于植物基因工程領域，尤其是涉及一種小麥WRKY轉錄因子基因及其在擬南芥應答高溫脅迫中的應用。

背景技術

小麥是我國第二大口糧作物，其穩產豐產是確保國家糧食安全的重要基礎。我國大部分麥區在小麥的籽粒灌漿期經常出現30℃以上的高溫，嚴重影響了小麥的產量和品質；另外，在我國北方和長江中下游麥區也常發生“高溫逼熟”災害。高溫脅迫造成小麥的生長發育紊亂，甚至干枯死苗，是限制我國小麥產量的主要自然災害之一。轉錄因子在植物基因表達中發揮中心調控作用，其中WRKY轉錄因子廣泛參與植物對生物和非生物逆境脅迫應答反應。但有關小麥WRKY轉錄因子參與調控耐熱應答的機制目前知之甚少。

發明內容

本發明的目的是提供一種小麥WRKY轉錄因子基因及其在擬南芥應答高溫脅迫中的應用。

本發明利用NCBI數據庫中的基因序列，查找與水稻WRKY基因cDNA同源的小麥EST片段，將部分重疊且高度同源的小麥EST進行序列拼裝,組合成具有WRKY結構域和完整ORF的cDNA序列，根據這些序列設計特異性PCR引物，采用RT-PCR的方法，獲得了TaWRKY71基因，并且構建了可誘導的超表達載體，利用模式植物擬南芥進行了轉基因的功能鑒定。

本發明的具體技術方案是：一種小麥WRKY轉錄因子基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

所述WRKY轉錄因子基因根據水稻OsWRKY71基因的序列，通過同源序列比對，擴增，連接，轉化，篩選、測序等分子生物學操作獲得，命名為TaWRKY71。

所述WRKY轉錄因子基因連接到超表達載體上，通過農桿菌介導轉化的方法，獲得轉基因擬南芥植株。

所述超表達載體為pKIGW-TaWRKY71。該載體中pOp6/LhGR系統的下游為GUS基因，上游為Gateway元件。pOp6/LhGR系統在地塞米松誘導后，pOp6雙向啟動子可同時表達GUS基因和Gateway元件中的TaWRKY71基因，因此通過GUS染色可以很方便的監測目的基因的表達情況。同時，此載體可以通過外源的化學誘導物地塞米松來控制目的基因的表達，具有著獨特的優勢。

本發明克隆了一種小麥WRKY轉錄因子基因TaWRKY71，構建可誘導的TaWRKY71超表達載體，用農桿菌介導轉化，獲得轉基因擬南芥植株，該轉基因擬南芥植株對高溫脅迫的抗性明顯下降，大多死亡，說明該基因參與了植物的熱調控網絡，為小麥的遺傳改良提供優良的基因資源。

附圖說明

圖1是含有本發明序列表中序列1基因TaWRKY71的表達載體pKIGW-TaWRKY71；

圖2是含有本發明序列表中序列1基因TaWRKY71的擬南芥；

圖3是轉基因植株的分子鑒定圖；

圖4是轉基因擬南芥與野生型植株經高溫脅迫后的生長情況比較。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。

一、小麥WRKY轉錄因子基因TaWRKY71的獲得

1.總RNA的提取：以小麥揚麥158葉片作為試驗材料，采用TIANGEN試劑盒，操作步驟如試劑盒說明所示，得到RNA溶液后，采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質量，-80℃保存。

2.cDNA的合成：cDNA的合成使用Invitrogen的SuperScript^TMⅢFirst-Strand?Synthesis?System?for?RT-PCR，具體步驟如下：

1)取0.5ml滅菌微量離心管，分別加入以下成分：總RNA11μL，Oligo(dT)1μL和10mM?dNTP1μL。混勻，輕甩離心管，使溶液集中至底部；

2)離心管置于水浴鍋內，65℃保溫5min；

3)迅速取出置于冰上冷卻1min以上，將離心管輕微離心；

4)在上述離心管中加入下列反轉錄反應液：5×First-strand?Buffer4μL，0.1M?DTT1μL，Recombinant?RNase?Inhibitor1μL，SuperScript^TMⅢRT1μL；

5)輕微震蕩混勻后短暫離心；

6)50℃保溫50min；

7)70℃保溫15min，-20℃保存。