[發明專利]一種肝素酶Ⅱ缺失突變體編碼基因及其蛋白

無效

• 申請號: 201410274912.8
• 申請日: 2014-06-19
• 公開（公告）號: CN104017796A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 杜宏銀;馬小來;李鋰
• 申請（專利權）人: 深圳市海普瑞藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N1/21
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及酶的基因工程改造，特別涉及到肝素酶Ⅱ缺失突變體編碼基因及其蛋白。

背景技術

肝素酶是一類作用于肝素或者硫酸乙酰肝素的多糖裂解酶，在許多微生物中發現，包括棒狀桿菌Corynebacterium?sp，枯草芽孢桿菌?Bacillus?subtilis?,環狀芽孢桿菌Bacillus?circulans，糞便擬桿菌和肝素黃桿菌等，?但肝素黃桿菌是商業化肝素酶的唯一來源。

肝素酶的研究頗具價值：肝素酶是一種多糖裂解酶，肝素酶及其底物多糖肝素之間相互作用的研究有助于解釋多糖裂解酶的作用機制；肝素酶可以用于解析肝素等復雜粘多糖的結構及其生物學功能；此外，肝素酶還可以用于解析人體內的凝血和抗凝血機制、制備低分子的抗凝血藥物低分子肝素、去除臨床血液殘存肝素、防止手術后出血、處理PCR反應前的血液制品。

對肝素酶Ⅱ的異源重組表達研究非常有限，文獻報道傅文彬和Su等人對其進行了研究。傅文彬等人利用pET表達系統實現了肝素酶Ⅱ在大腸桿菌中的重組表達（傅文彬，余曉等，黃桿菌肝素酶Ⅱ?的克隆與表達，食品與藥品，2007，Vol.9?：1-4)，SDS-PAGE電泳結果顯示有目的蛋白條帶，但表達量很低，且容易形成包涵體，可溶性肝素酶活性很低；Su研究中所表達的肝素酶Ⅱ活性有所提高，但純化困難（(Su?H，blain?F，Musil?RA，ZimmermannJ?JF，Gu?K，Bennett?DC.Isolation?and?Expression?in?Escherichia?coli?of?hepB?and?hepC，Genes?Coding?for?the?Glycosaminoglycan-Degrading?Enzymes?Heparinase?Ⅱ?and?Heparinase?Ⅲ，Respectively，from?Flavobacterium?heparinum.Appl.Environ.Microbiol.1996，62?：2723-2734)。CN?101942024研究發現通過將麥芽糖結合蛋白(MBP)與酶的融合可以顯著提高酶重組表達的可溶性，可提高酶Ⅱ的產量至118.4IU/L發酵液。

本實驗室對肝素酶Ⅱ的基因進行缺失突變，切除C端的一段氨基酸序列，將其克隆至表達載體PMAL-C2X，得到活性較高的肝素酶Ⅱ突變體蛋白HepB-1，且其帶有MBP標簽方便純化。

發明內容

本發明的目的是為了提供一種缺失突變的肝素酶Ⅱ基因以及表達蛋白。

本發明所提供的肝素酶Ⅱ蛋白，名稱為HepB-1，其肝素酶HepB-1是具有序列表中SEQ?IDNo:2氨基酸殘基序列的蛋白質。

序列表中的SEQ?ID?No:2由688個氨基酸殘基組成。

肝素酶Ⅱ缺失突變體蛋白編碼基因，名稱為HepB-1，其具有下列核苷酸序列之一：

????1)序列表中SEQ?ID?NO.1的DNA序列：

????2)編碼序列表中SEQ?ID?No.2蛋白質序列的多核苷酸；

????序列1中的DNA序列由2064個堿基組成，該基因的開放閱讀框架為自5’端第

1到第2064位堿基。

擴增該蛋白編碼基因中任一片段的引物對也在本發明的保護范圍之內。

本發明的第二個目的是提供一種表達缺失突變肝素酶Ⅱ蛋白的方法。

本發明所提供的表達缺失突變肝素酶Ⅱ蛋白的方法，是將含有上述肝素酶Ⅱ蛋白編碼基因的重組表達載體導入表達宿主菌，表達缺失突變肝素酶Ⅱ蛋白，且其帶有MBP標簽。

pMal-HepB-1是通過PSTI和SacI將肝素酶Ⅱ編碼基因全序列插入pMal-C2x?,pMal-c2x表達載體中得到的肝素酶Ⅱ蛋白編碼基因的重組表達載體。其中，所述肝素酶Ⅱ編碼基因全序列是以構建好的PMAL-C2X-HepA為模板，以5'-GCCTGAGCTCGCAAACCAAGGCCGATGTG?3和5'-GACTCTGCAGTTAACGATCAACAGTTTCTGAAGTTTTG?3為引物，按照常規PCR方法得到的。所述宿主菌可為大腸桿菌，所述大腸桿菌可為以下菌株：BL21。

缺失突變體肝素酶Ⅱ蛋白的誘導表達條件可為0.1mM?IPTG?.16攝氏度誘導18小時：所采用的培養基為LB培養基,胰蛋白胨10g/L,NaCl?10g/L，酵母提取物5g/L。