[發明專利]人類BRAF基因突變檢測引物對和探針及其試劑盒

在審

• 申請號: 201410274543.2
• 申請日: 2014-06-18
• 公開（公告）號: CN104017887A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 曾慶;張穎芬;張中滿
• 申請（專利權）人: 廣州好芝生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 王基才

技術領域

本發明涉及一種生物檢測試劑，更具體的說，本發明涉及一種人類BRAF基因突變檢測引物對和探針及采用該引物對和探針的檢測試劑盒。

背景技術

BRAF基因，全名鼠類肉瘤濾過性毒菌(V-Raf)致癌同源體B1，是RAF基因家族成員，編碼絲/蘇氨酸蛋白激酶，是癌基因RAS的效應器，也是MAPK級聯信號轉導組件，涉及多個生理過程，參與調控細胞內細胞生長、分化和凋亡等過程。在多種人類惡性腫瘤中，BRAF基因突變引起的持續激活可使MEK/ERK信號轉導紊亂，導致細胞過度增殖，出現惡性轉化，如黑色素瘤、結直腸癌、甲狀腺癌均存在不同比例的BRAF突變。約80-90％的BRAF基因突變發生在外顯子15的1799位核苷酸上，T突變為A，導致纈氨酸被谷氨酸取代(V600E)。

BRAF基因體細胞突變在乳頭狀甲狀腺癌中比較多見，BRAF?V600E突變被認為是PTC最常見的可遺傳變異，癌癥數據庫(COSMIC)在其網站上發表報告顯示，78000例存在BRAF基因突變的樣本中超過95％為V600E突變。BRAF基因突變作為乳頭狀甲狀腺癌(PTC)發生的驅動性突變，已經成為PTC細針穿刺細胞學標本診斷和病情預后的一個重要指標。BRAF基因突變率在PTC中高達44％，具有很好的診斷意義。BRAF基因突變陽性的甲狀腺癌病人較突變陰性病人預后不良。

在黑色素瘤的研究中發現，約50％的晚期黑色素瘤患者中發生了BRAF?V600E突變，在一些研究中其突變率甚至高于60％。2011年，首個新型BRAF?V600E靶向抑制劑威羅菲尼(Vemurafenib)被FDA批準上市，它能選擇阻斷RAF/MEK/ERK通道，抑制BRAF突變的黑色素瘤細胞增殖，療效顯著，與放化療相比能夠明顯延長無進展生存期和總生存期。

在結直腸癌研究中，BRAF基因突變是結直腸腫瘤預后較差的一個生物標志物，以及區分散發性結直腸癌與Lynch綜合征的分子指標。此外，BRAF基因突變的患者對EGFR靶向藥物可能存在原發耐藥，因此，美國國家癌癥綜合治療聯盟(NCCN)《結直腸癌臨床實踐指南》(2013)建議，在使用愛必妥(Cetuximab)或帕尼單抗(Panitumumab)等靶向藥物時，對KRAS基因野生型患者進一步檢測BRAF基因狀態。

目前，對基因突變的檢測分析技術方法主要包括：測序、限制性片段長度多態性方法(RFLP)、單鏈構象多態性(SSCP)、變性高效液相色譜(DHPLC)、基因芯片、液相芯片等方法。這些方法都有各自的優點和缺陷，尚有待改進和標準化。

1.直接測序：Sanger測序法因為可以讀到DNA每個堿基的變化，目前被認為是檢測基因突變的金標準方法。但是，因為靈敏度低(檢測突變靈敏度約為20％)，檢測異質性較高的臨床腫瘤組織樣本時假陰性率高。同時，測序步驟繁瑣、耗時長，對設備和操作人員的要求較高，檢測周期長，多限于在科研單位進行，大多數醫院都無法獨立完成檢測，不易于形成標準化操作、適合臨床單位應用的體外診斷產品。

2.限制性片段長度多態性方法(RFLP)：該方法成本低，對檢測設備要求低，突變基因的檢出限在5～10％。但是，勞動強度稍大、需專業的技術人員、不適于高通量檢測和大規模臨床應用。

3.SSCP、DHPLC、基因芯片、液相芯片等方法操作復雜、對設備要求高，僅在科研單位實驗室應用，不適合大范圍推廣使用。

發明內容

有鑒于此，本發明的所解決的技術問題在于克服現有技術的不足，提供一種檢測效果更好、特異性高、漏檢率低的人類BRAF基因突變的檢測引物對和探針。

本發明的所解決的技術問題還在于提供一種操作簡單快捷、特異性高、漏檢率低的人類BRAF基因突變的檢測試劑盒。

為了解決上述技術問題，一方面，本發明提供了一種人類BRAF基因突變檢測引物對和探針，用于熒光PCR檢測，所述引物對和探針的序列如下：

所述引物對包括針對涵蓋BRAF基因突變位點的特異性引物對和監控樣本DNA質量的內控引物對，所述特異性引物對為：

B-AR-F：GTGATTTTGGTCTAGCTACACA<SEQ?ID：1>，

B-AR-R：CTAGTAACTCAGCAGCATCTCA<SEQ?ID：2>；

所述內控引物對為：

B-IC-F：ATTGTTACCCAGTGGTGTGA<SEQ?ID：4>，