[發(fā)明專利]一種桉樹(shù)焦枯病原菌的巢式PCR檢測(cè)試劑盒及其使用方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410274443.X
• 申請(qǐng)日: 2014-06-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104017886A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱天輝;張靜;朱涵明月;李姝江;譙天敏;韓珊;王淋敏;張麗娜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種桉樹(shù)焦枯病原菌的巢式PCR檢測(cè)試劑盒及其使用方法。

背景技術(shù)

桉樹(shù)是世界著名的速生造林和用材林樹(shù)種，因其生長(zhǎng)快速、適生性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)效益明顯、材積材質(zhì)用途廣等特點(diǎn)而被世界各地的100多個(gè)國(guó)家廣泛引種種植。尤其在我國(guó)桉樹(shù)被大量引進(jìn)和推廣，桉樹(shù)種植區(qū)域日漸增加，橫跨淮河以南等十幾個(gè)省區(qū)，可見(jiàn)桉樹(shù)在我國(guó)林業(yè)經(jīng)濟(jì)建設(shè)中有著不可取代的地位。但是隨著桉樹(shù)種植密集度的增加，桉樹(shù)病害也隨之普及，尤其是以Cylindrocladium?scoparium(桉樹(shù)焦枯病原菌)真菌引起的桉樹(shù)焦枯病危害居于首位。桉樹(shù)焦枯病主要危害1-4年生桉樹(shù)幼苗，以及成熟桉樹(shù)的葉片和枝梢，受到病原菌侵染的桉樹(shù)輕則出葉枯、枝枯或頂枯，大量落葉，使桉樹(shù)頂部形成掃帚狀，嚴(yán)重時(shí)整株枯死。感病初期，健康桉樹(shù)葉片出現(xiàn)針頭狀大小的水澤斑，病斑逐漸擴(kuò)大，組織壞死如被燒灼，邊緣有一赤褐色暈圈，多數(shù)病斑連結(jié)造成葉尖和葉緣干枯，病葉卷曲；感病后期病斑中部變灰褐色燙傷狀，多數(shù)病斑連接成大的枯死斑塊，直至全葉卷曲焦枯脫落；枝條染病，表皮層遍布近圓形或長(zhǎng)條形的小點(diǎn)，病部微縊縮，有縱裂縫，擴(kuò)大后若病斑環(huán)繞枝干，可造成枝干干枯死亡。此外，該病原菌寄主十分廣，主要有尾葉桉、巨桉、巨尾桉、赤桉、藍(lán)桉、大葉桉、檸檬桉、柳窿桉、窿緣桉、纖脈桉、雷林桉1號(hào)、雷林桉等幾十個(gè)重要的桉樹(shù)品種。除此之外，Cylindrocladium?scoparium?真菌還能侵害相思樹(shù)、丁香年、橡膠樹(shù)、番石榴、柑橘、南美番荔枝、杜鵑花、腰果樹(shù)和木薯等重要的園林經(jīng)濟(jì)和商品林樹(shù)種。因此，探求有效、快速的Cylindrocladium?scoparium的檢測(cè)技術(shù)對(duì)桉樹(shù)焦枯病的防治具有重要的林業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐意義。

目前，世界各國(guó)學(xué)者對(duì)桉樹(shù)焦枯病的研究主要集中在桉樹(shù)焦枯病病原菌的分類、生物學(xué)特性、生理生化指標(biāo)、病原菌孢子的形態(tài)特征、結(jié)構(gòu)、以及遺傳特性方面，對(duì)桉樹(shù)焦枯病原菌分子檢測(cè)的研究暫無(wú)報(bào)道。建立桉樹(shù)焦枯病原菌快速檢測(cè)體系對(duì)于有效檢測(cè)桉樹(shù)焦枯病的發(fā)生和防治迫在眉睫。

分子生物學(xué)診斷技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)與分子遺傳學(xué)取得巨大進(jìn)步的結(jié)晶，是在人們對(duì)基因的結(jié)構(gòu)以及基因的表達(dá)和調(diào)控等生命本質(zhì)問(wèn)題的認(rèn)識(shí)日益加深的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。近年來(lái)，分子生物學(xué)診斷技術(shù)的方法學(xué)研究取得了很大進(jìn)展，先后建立了限制性內(nèi)切酶酶譜分析、核酸分子雜交、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性連鎖分析等方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的日漸成熟，PCR檢測(cè)技術(shù)也被越來(lái)越多的應(yīng)用到植物真菌、細(xì)菌、植原體、病毒、線蟲(chóng)等多種病菌的鑒定和檢測(cè)中。然而常規(guī)的PCR檢測(cè)往往出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和假陽(yáng)性的現(xiàn)象，以致于誤導(dǎo)人們對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的判定。巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，使用兩對(duì)(而非一對(duì))PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對(duì)引物稱為巢式引物(因?yàn)樗麄冊(cè)诘谝淮蜳CR擴(kuò)增片段的內(nèi)部)結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低，巢式PCR的擴(kuò)增非常特異，很好的解決了常規(guī)PCR擴(kuò)增中出現(xiàn)的問(wèn)題。建立快速、靈敏的巢式PCR擴(kuò)增體系對(duì)于檢測(cè)桉樹(shù)焦枯病的林業(yè)診斷具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)在檢測(cè)桉樹(shù)焦枯病原菌中存在的不足，提供了一種桉樹(shù)焦枯病原菌的巢式PCR檢測(cè)試劑盒及其使用方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種桉樹(shù)焦枯病原菌的巢式PCR檢測(cè)試劑盒，其包括：

(1)10×PCR?Buffer；

(2)25mmol/L?Mg²⁺；

(3)10mmol/L?dNTP；

(4)引物：10mmol/L?BT-T1-S，10mmol/L?BT-CYLTUBIR-A，10mmol/L?BT-S-1，10mmol/L?BT-A-1；其中引物BT-T1-S的序列為5＇－AACATGCGTGAGATTGTAAGT－3＇，引物BT-CYLTUBIR-A的序列為5＇－AGTTGTCGGGACGGAAGAG－3＇，引物BT-S-1的序列為5＇－GGCTCCAAGAACTATGTGA－3＇，引物BT-A-1的序列為5＇－CCTAACCACGAATGTCAGT－3＇；

(5)5U/μL?Tag聚合酶；

(6)ddH₂O。

所述的巢式PCR檢測(cè)試劑盒的使用方法，其步驟如下：