[發(fā)明專利]一種整體胚胎免疫染色試劑盒及其使用方法和用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410273493.6
• 申請日: 2014-06-18
• 公開（公告）號: CN104062426A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 白仲添;孟文勃;李汛;周文策;狄翠霞;嚴俊
• 申請（專利權(quán)）人: 蘭州大學第一醫(yī)院
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及試劑盒技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種整體胚胎免疫染色試劑盒及其使用方法和用途。

背景技術(shù)

傳統(tǒng)的免疫熒光染色通過免疫化學的方法，實現(xiàn)組織或細胞中特異抗原抗體的結(jié)合，對某一蛋白分子或多種蛋白分子實現(xiàn)熒光標記，達到定性、定量分析目的，并可將標記熒光素的二抗直接結(jié)合到一抗上，通過熒光吸收光進行檢測。近年來，免疫組化逐漸應(yīng)用到對早期胚胎的整體染色，完整地對神經(jīng)纖維、器官、干細胞遷移等進行標記，但目前應(yīng)用的整體胚胎的免疫熒光化學染色因固定后胚胎中殘留PFA對熒光素的吸收導(dǎo)致背景熒光干擾，使得后期圖片采集及數(shù)據(jù)處理都受到很大的影響；因目前配方的缺陷，導(dǎo)致胚胎在免疫雜交過程中受到不同程度的損傷，影響整體胚胎染色效果；另外，目前廣泛應(yīng)用的整體胚胎熒光化學染色方法，配方方法復(fù)雜凌亂、復(fù)雜、耗時長。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明專利的目的在于提供一種試劑盒及染色方法在一個反應(yīng)相中對脊椎動物早期胚胎、神經(jīng)纖維、神經(jīng)干細胞的整體免疫熒光染色的應(yīng)用。

本發(fā)明專利主要是通過快速便捷的操作方法，對胚胎實行整體胚胎神經(jīng)纖維、神經(jīng)干細胞以及其他組織的熒光染色。無背景干擾、不損壞胚胎完整性。用于胚胎發(fā)育早期神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等多種系統(tǒng)的形態(tài)學研究。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的整體胚胎免疫染色試劑盒，是由固定液、漂白液、封閉液和抗體稀釋液組成，各試劑的體積比組成如下：固定液：甲醇75-85％、二甲基亞砜15-25％；漂白液：甲醇65-75％、二甲基亞砜15-25％、雙氧水5-15％；封閉液：PBT稀釋的1-5％馬血清+1-5％牛血清白蛋白；抗體稀釋液：PBT+1-2.5％牛血清白蛋白+0.2-0.4％NaN₃。

所述的雙氧水的濃度為30％。

PBT是由1×磷酸鹽緩沖溶液和0.01-0.1％的吐溫20組成，其中磷酸鹽緩沖溶液的pH為7.2；優(yōu)選PBT是由1×磷酸鹽緩沖溶液和0.02％的吐溫20組成，其中磷酸鹽緩沖溶液的pH為7.2。

本發(fā)明的整體胚胎免疫染色試劑盒的染色方法步驟如下：

固定：將胚胎放入加入固定液的帶蓋試管中(試管材質(zhì)不限)。4℃固定1-7天。

漂白：倒掉固定液，加入漂白液，4℃固定12-24h。

復(fù)水：倒掉漂白液，加入100％甲醇震蕩清洗3×10-30min(根據(jù)胚胎大小而定)，倒掉清洗液，加入50％甲醇震蕩清洗3×10-30min(根據(jù)胚胎大小而定)，加入PBT4℃震蕩清洗6×1h。

封閉：倒掉反應(yīng)相中的清洗液，加入封閉液，4℃2-4h或室溫30分鐘震蕩封閉(根據(jù)胚胎大小而定)。

一抗雜交：按照抗體說明書及參考文獻，將合適量的一抗加入抗體稀釋液，在反應(yīng)相中加入稀釋過的一抗溶液。冰上震蕩孵育8-20h或過夜。

清洗：加入PBT4℃或冰上震蕩清洗6×1h。

二抗雜交：按照抗體比例，將熒光二抗加入抗體稀釋液，在反應(yīng)相中加入稀釋過的二抗溶液。4℃避光震蕩孵育12-24h或過夜(將試管包裹在鋁箔紙中)。

清洗：加入PBT4℃震蕩清洗6×1h(或4℃過夜)

成像：激光共聚焦顯微鏡或雙光子顯微鏡成像效果更佳(具體選擇根據(jù)熒光強度及胚胎大小而定，胚胎較小用雙光子顯微鏡，較大用共聚焦顯微鏡)。

本發(fā)明的積極效果如下：

本發(fā)明的整體胚胎免疫染色試劑盒及其使用方法具有以下優(yōu)點：1、設(shè)備簡單，操作簡便，只需要在一個反應(yīng)相中即可完成；2、費用低廉，除抗體外，其他均為實驗室常規(guī)試劑，無特殊污染物殘留；3、染色效果好，無背景熒光雜色干擾，且組織完整性好。

附圖說明

圖1是雞胚整體胚胎的免疫熒光染色的圖。

圖中白色部分為3A10抗體標記的副神經(jīng)及脊神經(jīng)的神經(jīng)纖維。Delete NC表示對該胚胎神經(jīng)嵴細胞行顯微切除。D為背側(cè)；V為腹側(cè)；R為頭側(cè)；XI表示第十一對腦神經(jīng)副神經(jīng)。

圖2是雞胚的神經(jīng)軸突尋路特征的熒光染色圖。

具體實施方式

下面的實施例是對本發(fā)明的進一步詳細描述。

實施例1

本發(fā)明的整體胚胎免疫染色試劑盒，是由固定液、漂白液、封閉液和抗體稀釋液組成，各試劑的體積比組成如下：固定液：甲醇75％、二甲基亞砜25％；漂白液：甲醇65％、二甲基亞砜25％、雙氧水10％；封閉液：PBT稀釋的1％馬血清+5％牛血清白蛋白；抗體稀釋液：PBT+1％牛血清白蛋白+0.4％NaN₃。

所述的雙氧水的濃度為30％。