[發明專利]菊芋離體莖尖超低溫保存及再生培養方法

有效

• 申請號: 201410273221.6
• 申請日: 2014-06-18
• 公開（公告）號: CN104012524B
• 公開（公告）日: 2018-08-31
• 發明（設計）人: 陳曉玲;韓麗;張金梅;盧新雄;辛霞;尹廣鹍;何娟娟
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院作物科學研究所
• 主分類號: A01N3/00
• 分類號: A01N3/00;A01H4/00
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

本發明提供一種菊芋離體莖尖超低溫保存及再生培養方法，包括以下步驟：材料獲得、莖尖剝取、蔗糖預培養、裝載液裝載、PVS2玻璃化保護液脫水處理、超低溫冷凍保存、解凍洗滌和恢復再生培養步驟。采用本發明的小滴玻璃化法超低溫保存技術，超低溫保存后的菊芋試管苗離體莖尖經過化凍處理，恢復培養后直接再生成苗。表明該方法是一種長期安全、穩定可靠、簡單有效的保存菊芋種質資源的方法，存活率可達90％以上，再生率可達80％以上，再生植株恢復生長良好。

技術領域

本發明涉及植物種質資源的超低溫保存方法，，具體地說，涉及菊芋離體莖尖超低溫保存及再生培養方法。

背景技術

菊芋(Helianthus tuberous L.)又名‘洋姜’、‘鬼子姜’，為菊科向日葵屬多年生草本植物，因其地上似菊，地下似芋而得名。原產北美洲，在美國、加拿大、墨西哥等國均有廣泛分布。17世紀經歐洲傳入我國，目前分布在東北三省、內蒙古、北京、河北、河南、湖北、湖南、甘肅、青海、浙江、陜西、新疆、安徽、寧夏、江蘇、山東、山西等省市。菊芋具有很強的抗逆性，生態適應性很廣。菊芋為無性繁殖作物，其繁殖能力很強，地下塊莖繁殖速度可達每年20倍以上。菊芋是一種不可多得的生態經濟型植物，喜溫暖、耐嚴寒、耐鹽堿，具有很高的經濟價值、藥用價值、觀賞價值和生態價值。菊芋在工業上應用廣泛，利用其塊莖轉化成乙醇和生物燃料等生物能源，應用于化工、生物制藥、航天等領域。菊芋塊莖中含有豐富的菊粉，是理想的功能性食品配料，用作甜味增味劑，營養價值高。菊芋地上部分生物量很大，莖葉可直接用于家畜的青飼料，被聯合國糧農組織稱為“21世紀人畜共用作物”。菊芋可入藥，性甘味涼，有清熱解毒之功效，提取的菊糖對血糖具有雙向調節的作用，對糖尿病的治療具有很好的防治作用。菊芋含有的菊粉及低聚果糖還具有超強增殖人體雙歧桿菌的作用。

菊芋種質資源目前主要采用非原生境保存中的田間圃位保存和試管苗保存。田間圃位保存時，易受環境的影響而導致種質消失。如地下塊莖容易受到病毒的侵害，使病毒大量積累，導致品種退化，產量降低；另外，城市土地開發、環境惡化也嚴重威脅菊芋種質資源的安全保存。試管苗保存雖然具有占地面積小、不易受自然災害和病原菌影響以及人力、財力投入少、便于種質資源交換及運輸等優點，但需要經常繼代更新，且經過多次繼代培養后面臨發生退化現象或產生變異等威脅。

超低溫保存技術是可長期安全保存種質資源的可選擇的較佳途徑之一，不但節約空間，而且成本低廉。現已開發出多種超低溫保存方法，然而針對不同物種甚至對于同一物種的不同品種，其適宜的超低溫保存方法及程序技術都有可能不同。迄今為止，國際上尚未建立起具有普適性的超低溫保存方法，這也是超低溫保存技術實際應用中的主要瓶頸之一。

發明內容

本發明的目的是提供一種菊芋離體莖尖超低溫保存及再生培養方法。

為了實現本發明目的，本發明基于小滴玻璃化法超低溫保存技術，提供的一種菊芋離體莖尖超低溫保存及再生培養方法，包括以下步驟：材料獲得、莖尖剝取、蔗糖預培養、裝載液裝載、PVS2玻璃化保護液脫水處理、超低溫冷凍保存、解凍洗滌和恢復再生培養步驟。

材料獲得具體步驟如下：

1)將菊芋塊莖種植到花盆中，待其生長到35-45cm(優選40cm)，剪下生長健壯的枝條作為外植體，將其剪成2-3.5cm長(優選3cm)的帶芽莖段，用水沖洗表面污漬，用10％NaClO溶液表面消毒8～9min(優選8min)，無菌水沖洗3～5次后，將外植體接種到MS+15g/L蔗糖+8g/L瓊脂培養基中進行試管苗培養；

2)試管苗生長穩定后轉入MS+0.1mg/L GA₃+15g/L蔗糖+8g/L瓊脂培養基中進行試管苗擴繁培養；培養溫度為20±1℃，光照14h/d，光照強度2000～3000lux。

莖尖剝取具體方法如下：經試管苗培養，選取生長4～5周的健康植株，在無菌條件下，剪取帶頂芽的莖段，去除包裹在外面的大葉片，然后在顯微鏡下剝去小葉片，切取大小2～3mm，帶2個葉原基的莖尖。